動物淋巴管內皮細胞的分離

基本方案1：灌注消化法

實驗材料：

1. 哺乳動物胸導管淋巴管

2. 1×PBS，含青霉素100u/ml和鏈霉素100μg/ml，pH7.4

3. 0.2%Ⅰ型膠原酶

4. 眼科剪，眼科鑷

5. 慕絲線（7號線）、細鐵絲

6. 離心管（15ml、50ml）

實驗方法：

1. 處死動物后，打開胸腔，分離胸導管，在胸導管上端結扎，切取10-15cm的一段。將胸導管放入預冷PBS中漂洗。

2. 在解剖顯微鏡下，用眼科剪和眼科鑷剝除外膜的脂肪和纖維組織，然后用PBS反復沖洗管腔。

3. 將胸導管移入含PBS的大培養(yǎng)皿中，清洗3次。在胸導管的遠端插入靜脈留置針，并結扎固定。用PBS沖洗管腔后，將游離端結扎。用靜脈留置針向管腔內注入消化液，至淋巴管充盈為止。在37℃條件下，消化10min。淋巴管的管壁較薄，灌注消化時間不宜過長，以免消化過度，引起成纖維細胞的污染。

4. 取出胸導管，在游離端剪一小口，用離心管收集消化液，然后用培養(yǎng)液沖洗管腔，收集消化液和沖洗液，以1000r/min，離心10min。離心后吸去上清液，用培養(yǎng)液輕輕混懸細胞。

5. 將細胞接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后補充培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2-3d換液1次。換液時，吸去1/2-2/3培養(yǎng)液，再加入新鮮培養(yǎng)液。

6. 原代培養(yǎng)4-6h后，大部分細胞已貼壁生長。24h后，內皮細胞形成由數個細胞組成的細胞群。淋巴管內皮細胞的活性較低，原代培養(yǎng)時細胞生長緩慢。2-3周后，細胞生長形成單層。淋巴管內皮單層呈卵石狀特征性排列，可傳代培養(yǎng)。

基本方案2：植塊培養(yǎng)法

實驗材料：

1. 哺乳動物胸導管或腸系膜淋巴管

2. 1%明膠鋪底，置超凈臺晾干

3. 1×PBS，含青霉素100u/ml和鏈霉素100μg/ml，pH7.4

4. 眼科剪，眼科鑷

5. 慕絲線（7號線）、細鐵絲

6. 離心管（15ml、50ml）

實驗方法：

1. 處死動物后，打開胸腔，分離胸導管，在胸導管上端結扎，切取10-15cm的一段。將胸導管放入預冷PBS中漂洗。

2. 在解剖顯微鏡下，用眼科剪和眼科鑷剝除外膜的脂肪和纖維組織，然后用PBS反復沖洗3次。用虹膜剪縱向切開管腔，再用PBS沖洗管腔面。然后，將管腔剪成約1mm3 的小塊。

3. 將組織快放入培養(yǎng)皿中，使內膜面朝下，放入37℃，含5%CO2 的孵箱中培養(yǎng)4h。加入培養(yǎng)液，胸導管組織塊能否貼壁是內皮細胞培養(yǎng)的關鍵。因此，加入培養(yǎng)液時操作要輕，以免使組織塊浮起。

4. 靜置培養(yǎng)3d后換液，以后每隔2-3d換液1次。培養(yǎng)4-6d后，內皮細胞開始自植塊長出，細胞呈長梭形或多邊形。2-3周后，細胞生長形成單層。待細胞生長形成單層時，可傳代培養(yǎng)。

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