長白豬精原細胞的分離和純化

一、材料和方法

1、實驗動物

長白種系公豬，2月齡，由北京養(yǎng)豬中心葦溝現(xiàn)代化豬場提供。取活體睪丸，立即放入1640營養(yǎng)液中，待分離細胞。

2、主要試劑及材料

膠原酶（CLS，Sigma），胰蛋白酶（Sigma），脫氧核糖核酸酶（DNase,Promega），牛血清白蛋白（BSA，中國醫(yī)學科學院天津血液研究所），胎牛血清（FBS，Gibco），RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco，臨用前配制，加鏈霉素及青霉素至終濃度分別為100mg L及80IU ml，調(diào)pH至7 3），其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。800ml容量的細胞沉降池（定做）。

實驗用金屬及玻璃器皿用前均清洗干凈并高壓滅菌處理。

3、石蠟切片的制備及染色

新鮮睪丸除去包膜及白膜，切取0 5~1 0cm3左右的小塊，立即置入Bouin固定液中，4℃固定24h。按常規(guī)步驟制作石蠟切片，HE染色。

4、單細胞懸液的制備

無菌操作置睪丸于PBS溶液中，小心切開包膜，除去脂肪、附睪及白膜，切取1g左右睪丸組織，用彎剪剪成1mm3大小的碎塊，移入離心管，加5ml含0.5g L膠原酶的PBS，33℃溫育15min，其間不斷震搖并用吸管吹吸數(shù)次。靜置4~5min，待組織和細胞沉降管底后，棄上清。

重復上述步驟1次。加入5ml含0.5g L胰蛋白酶和1.0mg LDNase的PBS，33℃，溫育15min，吸管輕輕吹打3min直至滴片鏡檢時視野中全是散在的單細胞及少量小的細胞團。1000r min離心10min，棄上清，并用PBS清洗兩次，細胞沉淀最后重懸在含0. 5%BSA的PBS中，100目篩網(wǎng)過濾，制成單細胞懸液并進行細胞計數(shù)。

5、細胞的沉降分離

固定沉降池并保持水平狀態(tài)，池底下口周圍加數(shù)十粒硅化玻璃珠。10mlPBS及10ml待分離的單細胞懸液按先后從底部下口載入沉降池。用1640培養(yǎng)液分別配制4%和2%的BSA溶液各250ml，同時分別倒入梯度發(fā)生器的兩個容器中。

梯度發(fā)生器出液口直接用橡膠軟管連接于沉降池的底部尖嘴下口。打開活塞，調(diào)整流速，使BSA溶液以15ml min的速度從底部進入沉降池。最終沉降池內(nèi)的液體從上而下形成2%~4%的BSA連續(xù)梯度。

整個沉降系統(tǒng)4℃靜置3h，以使細胞按不同大小在BSA連續(xù)梯度介質(zhì)中通過自然重力沉降而分層。分層后的細胞溶液從沉降池底部下口用自動收集器收集，控制流速為5ml/min，10ml 管作為1份。1000r min離心10min，沉淀細胞，棄上清。

細胞重懸于0.5ml含0 5%BSA的1640培養(yǎng)液中。將各管細胞分別滴片，HE染色，光學顯微鏡下檢測細胞的形態(tài)結構特征及均一程度，以確定細胞的類型及純度。合并同類細胞，取1滴細胞懸液，加10μl0.4%臺盼藍，計細胞總數(shù)及死亡細胞百分比。

最后調(diào)整細胞濃度為106個/ml。滴片，染色。顯微鏡下任選5個視野，計算細胞純度。

6、細胞的貼壁培養(yǎng)及純化

經(jīng)沉降分離的精原細胞中混有少量支持細胞及間質(zhì)細胞，將此細胞懸液接種到一次性無菌培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2及飽和濕度等條件下培養(yǎng)6~8h，支持細胞和間質(zhì)細胞貼壁而精原細胞尚未貼壁，輕輕搖動培養(yǎng)瓶使精原細胞充分懸浮，吸出培養(yǎng)液，顯微鏡下再次檢測細胞純度及數(shù)量，并計算均值。

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