貼壁細胞傳代

貼壁細胞細胞在培養瓶長成致密單層后，繼續生長的空間不足，培養基中的營養成份也消耗較多，同時代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養，對細胞進行傳代擴增。

對于貼壁不太緊的細胞如293，可以直接吹散后分瓶。而對于貼壁較緊的細胞如CHO，則需要以胰酶消化后再吹散分瓶，一般過程為 （以下操作均按無菌操作的要求進行）：

將長成致密單層細胞的細胞瓶中原來的培養液棄去；

加入0.25%胰酶溶液，視細胞瓶的大小加入體積為0.5ml或更多，以使充分浸潤；

一般消化時間約為1至3分鐘，肉眼觀察瓶壁半透明的細胞層，當見到出現細******空隙時，棄去胰酶溶液，并加入適量的細胞培養液終止消化；

視實驗要求分入多瓶繼續培養，一般為一傳二到一傳四的比例。

這里，胰酶消化的程度是一個關鍵：消化過度則對細胞的活性損傷較大，并有部分細胞漂浮，隨棄去的胰酶流失；消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下，反復吹打同樣也會損傷細胞活性。

影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配制條件、凍存或4℃保存時間長短、是否反復凍融、化凍后存放時間及溫度等）、消化時的溫度（氣溫、細胞培養瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等。以筆者的經驗，以輕吹或加培養液后輕搖可下較好，但對于經驗不太充分的實驗者而言是較難判斷掌握的。 下面將細胞生長及不同消化程度的光學顯微鏡照片列出以供參考。

所用細胞為CHO貼壁細胞，培養基為含10%小牛血清的DMEM-F12，倒置顯微鏡10X40，數碼相機300萬像素。

取細胞凍存管一支，于40°C水中速融；25ml細胞方瓶中加入含10%COSMIC小牛血清的DMEM-F12培養基10ml，將凍存管中細胞全部洗入瓶中，置37°C 2.5%二氧化碳孵箱中靜置培養。4小時后倒去全部培養基以去除凍存液，更換10ml培養基，同上靜置培養。

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