血小板活化檢測方法
1 ． 臨床意義
心肌梗塞、腦血管血栓形成、深靜脈血栓形成、腦栓塞和肺栓塞等血栓性疾病在中國有很高的發(fā)病率，也是致死的重要原因。血小板活化是血栓形成的重要環(huán)節(jié)，檢測血小板的活化狀態(tài)可輔助診斷和監(jiān)控血栓性疾病，對判斷血栓前狀態(tài)意義也非常重大。
2 ． 檢測原理
靜止狀態(tài)的血小板內(nèi)分布著多種顆粒，如 a 顆粒、溶酶體顆粒等。這些顆粒表面存在著一些特定蛋白，如 a 顆粒表面有 CD62p 抗原，溶酶體顆粒表面有 CD63 抗原。血小板活化時，由于顆粒膜蛋白與血小板膜蛋白相互融合，使顆粒膜蛋白翻轉(zhuǎn)到血小板膜表面。因此，可通過檢測這些顆粒膜蛋白來判斷血小板的活化狀態(tài)。
3. 采血
EDTA 抗凝采血，取后段血。因前段血中可能有組織液存在，造成人為血小板活化。
4. 試劑選擇
FITC 標記的 CD42b 抗體
PE 標記的 CD62p 或 CD63 抗體
在血小板膜表面穩(wěn)定表達的抗原有 CD41/CD61(GPIIb/IIIa) 和 CD42a, CD42b 等，這些抗原均可作為血小板的標志。但因中國存在著一部分血小板無力癥患者，其血小板表面缺乏 CD41/CD61(GPIIb/IIIa) 。因此，一般使用 CD42b 來鑒別血小板。
因一般情況下， CD62p 和 CD63 的表達率均較低，需用 PE 等熒光較強的熒光素標記檢測。
5. 染色
a. 全血法：
1) 取試管 A( 陰性對照 ) 和試管 B( 測定管 ) ，均加入 5ml 抗凝全血和 200ml PBS
2) A 管中加入適量的 CD42b-FITC 和陰性對照抗體 ( 對應(yīng)于 CD62-PE 或 CD63-PE)
B 管中加入適量的 CD42b-FITC 和 CD62-PE 或 CD63-PE 抗體
3) 室溫，避光孵育 25 分鐘
4) 加 2 ml PBS ，上機檢測
血小板在體外隨著時間的延長會自發(fā)活化，所以由采血到檢測一般要在 3 小時內(nèi)完成 。
b. 固定法：
1) 抗凝全血 800rpm 離心 10 分鐘，取上清液即 PRP( 富血小板血漿 )
2) 以等體積 1-2% 的多聚甲醛固定 10 分鐘
3) PBS 洗滌 1 次，用 PBS 調(diào)節(jié)細胞濃度為 1 × 107 個 /ml 左右
4) 分別在試管 A( 陰性對照 ) 和試管 B( 測定管 ) 進入 100ml 血小板懸液
5) A 管中加入適量的 CD42b-FITC 和陰性對照抗體 ( 對應(yīng)于 CD62-PE 或 CD63-PE)
B 管中加入適量的 CD42b-FITC 和 CD62-PE 或 CD63-PE 抗體
6) 其余步驟同全血法
固定法可避免血小板在體外因時間或操作造成的人為活化，固定后的血小板可在 5 天內(nèi)檢測。
而固定法的步驟較為繁瑣，耗費時間，且在制備 PRP 時需離心，容易帶來人為活化。所以很多實驗室還是傾向于全血法。但是如果采血后不能立即檢測 (3 小時內(nèi) ) ，則需用固定法。
6. 分析
1) 用 CD42b 表達量和側(cè)向散射光設(shè)門來選定血小板
選定血小板過去常用的方法是 FS(C)/SS(C) 設(shè)門，根據(jù)細胞的大小與顆粒度來確定血小板。然而血小板的大小不一，有些血小板較大，容易與紅細胞相混淆，尤其當活化時，血小板與白細胞發(fā)生粘附，在 FS(C)/SS(C) 圖上進入白細胞群，使得一部分血小板丟失，因此應(yīng)用該法對血小板進行選定不夠準確。
目前公認的方法是用血小板特異性標志來選定血小板，因無論血小板大小，無論其是否活化，均穩(wěn)定表達 CD41/CD61(GPIIb/IIIa) 和 CD42a 等，因此可以非常精確地區(qū)分血小板。
2) 做陰性對照管，調(diào)節(jié)陽性區(qū)的假陽性率為 1-2%
3) 做測試管，得出 CD62p 的表達率，及血小板活化的百分率 .
