米氏常數（Km）和最大反應速度（Vm）的測定

酸性磷酸酯酶動力學性質分析

米氏常數（Km）和最大反應速度（Vm）的測定

原理

在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對酶促反應的速度有很大的影響。在底物濃度很低時，酶促反應的速度（v）隨底物濃度的增加而迅速增加；隨著底物濃度的繼續增加，反應速度的增加開始減慢；當底物濃度增加到某種程度時，反應速度達到一個極限值（Vmax）。

底物濃度與反應速度的這種關系可用Michaelis-Menten方程式表示：

式中

v——反應速度；

Km——米氏常數；

Vmax——酶反應最大速度；

[S] ——底物濃度。

從米氏方程式可見：米氏常數Km等于反應速度達到最大反應速度一半時的底物濃度，米氏常數的單位就是濃度單位(mol/L或mmol/L)。

在酶學分析中，Km是酶的一個基本特征常數，它包含著酶與底物結合和解離的性質。Km與底物濃度、酶濃度無關，與pH、溫度、離子強度等因素有關。對于每一個酶促反應，在一定條件下都有其特定的Km值，因此可用于鑒別酶。

測定Km、Vmax，一般用作圖法求得。作圖法有很多，最常用的是Linewaver-Burk作圖法，該法是根據米氏方程的倒數形式，以1/v對1/[S]作圖，可得到一條直線。直線在橫軸上的截距為 -1/Km，縱截距為1/Vmax，可求出Km與Vmax。

方法和步驟

1、制作標準曲線

取9支試管，按0～8編號。

1～8號管分別加入0.1至0.8mL酚標準應用液，并用蒸餾水將各管體積補充至1.0mL，0號管中加入1.0mL蒸餾水。

各管各加1mol/L碳酸鈉溶液2.0mL和Folin-酚稀溶液0.5mL，搖勻后，35℃保溫顯色10分鐘。

以0號管作空白，在可見光分光光度計680nm波長處讀取各管的吸光度A 680 。

整個操作過程見下表：

以酚含量(μmol)為橫座標，以A 680 為縱坐標，繪制標準曲線。

2、測定Km、Vmax

取試管 7支，按照0～6編號，空白管為0號。

各管按下表加入不同體積5mmol/L磷酸苯二鈉溶液(pH5.6)，并分別補充0.2mol/L pH5.6乙酸鹽緩沖液至0.5mL。

35℃預熱2min后，逐管記時加入酸性磷酸酯酶酶液0.5mL，搖勻，精確反應15min。

各管反應時間到達后立即加入1mol/L碳酸鈉溶液2mL，搖勻，再加入Folin-酚稀溶掖0.5 mL，35℃保溫顯色l 0min。

0號管內最后加入0.5 mL酶液，其它操作與上述各管相同。

冷卻后以0號管作空白，在可見光型分光光度計 680nm波長處讀取各管的吸光度A 680 。

在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對酶促反應的速度有很大的影響。

在底物濃度很低時，酶促反應的速度（v）隨底物濃度的增加而迅速增加；隨著底物濃度的繼續增加，反應速度的增加開始減慢；當底物濃度增加到某種程度時，反應速度達到一個極限值（Vmax）。

結果與計算

1、從酚標準曲線上查出各管A 680 相當的酚含量，計算各種底物濃度下的反應初速度v。

2、以1/v為縱坐標，1/[S]為橫坐標作圖，求出Km和Vmax。

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