血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性測(cè)定
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
1．掌握血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定的基本原理。
2．了解血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的測(cè)定方法及臨床意義。
實(shí)驗(yàn)原理
丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)催化丙氨酸與α—酮戊二酸生成丙酮酸和谷氨酸。
丙酮酸產(chǎn)量的多少，即反應(yīng)酶活性的大小。
丙酮酸可與2,4—二硝基苯肼在酸性溶液中反應(yīng)形成相應(yīng)的2,4-二硝基苯腙，呈黃色，后者在堿性條件下呈紅棕色。
通過(guò)測(cè)定其在520nm波長(zhǎng)處的光吸收來(lái)了解丙酮酸的生成量，借此測(cè)定血清ALT的活力，故該類(lèi)方法又稱(chēng)比色測(cè)定法。該法雖然也有缺點(diǎn)，但操作簡(jiǎn)便，不需要特殊 儀器 和 試劑 ，故在臨床上被廣泛應(yīng)用。
該法的單位定義是:每lml血清在pH7.4, 37℃/>保溫條件下與底物作用30分鐘,每生成2.5μg丙酮酸為一個(gè)單位。人血清的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶正常值為2～40U。
器材和試劑
1.器材 恒溫水浴、721、722分光光度計(jì)、液體混合器、刻度吸量管、滴管、 試管 等
2.試劑
(1) 0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)：稱(chēng)取無(wú)水磷酸二氫鉀（KH 2 PO 4 ） 2.69克/>和磷酸氫二鉀K 2 HPO 4 · 3H 2 O 13.97g/>加蒸餾水溶解后移至1 000ml容量瓶中，校正pH到7.4，然后加蒸餾水至刻度。貯存于冰箱中備用。
(2)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶底物液(pH7.4)：精確稱(chēng)取DL－丙氨酸 1.78g/>和α—酮戊二酸 29.2g/>，先溶于0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液約50ml中，然后用1mol/L NaOH 校正pH到7.4，再用磷酸緩沖液稀釋到 100ml。充分混勻，冰箱保存，可保存一周。
(3)0.02% 2,4-二硝基苯肼溶液( 1mM/>)：精確稱(chēng)取2,4-二硝基苯肼20mg溶于1mo1／L鹽酸中，待溶解后用1mo1／L鹽酸稀釋至100ml過(guò)濾后使用。
(4) 0.4M/>/L氫氧化鈉溶液。
(5)丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液(500μg/ml)：精確稱(chēng)取丙酮酸鈉62.5mg溶于0.1mol/LH 2 SO 4 100ml中, 此試劑需現(xiàn)用現(xiàn)配。
操作步驟
1．標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 取干燥潔凈 試管 9支，編號(hào)，按下表加入試劑，混勻：
另取干燥潔凈試管11支，編號(hào)，在1～9號(hào)試管中依次加入上述稀釋的1～9號(hào)丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液0.1ml，在10號(hào)管中加入未經(jīng)稀釋的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液(500μg/ml) 0.1ml,再按下表操作。
各管混勻，于室溫靜置10分鐘，520nm波長(zhǎng)，以第11管為空白管比色，讀取各管光密度將各管丙酮酸含量（5－50μg）按下式換算成谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力單位:
以每100ml血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活力單位為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
2．酶活性的測(cè)定 取干燥潔凈試管2支，標(biāo)明測(cè)定管和對(duì)照管，按下表操作。
混勻，靜置10min，用分光光度計(jì)，在520nm波長(zhǎng)，用 蒸餾 水調(diào)節(jié)零點(diǎn)，讀取測(cè)定管和對(duì)照管光密度，以測(cè)定管光密度值減去對(duì)照管光密度值，然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其酶的活力單位。
注意事項(xiàng)
1．標(biāo)本應(yīng)空腹取血，當(dāng)時(shí)進(jìn)行測(cè)定或?qū)⒎蛛x的血清貯存于冰箱中。
2．酶的測(cè)定結(jié)果與酶作用時(shí)間、溫度、PH及試劑加入量等有關(guān)，在操作時(shí)均應(yīng)準(zhǔn)確掌握。
3．測(cè)定試劑更換時(shí)，要重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
臨床意義
ALT廣泛存在于一般組織細(xì)胞中,肝細(xì)胞中此酶含量最多。肝炎、中毒性肝細(xì)胞壞死等肝病時(shí)，血清中此酶活性增加，其他疾病如心肌梗塞、心肌炎等亦有增高。故血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性得測(cè)定在臨床診斷上具有重要意義。
附注
1 ． 酶活力的意義及測(cè)定方法 研究酶促反應(yīng)速度和各種因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響時(shí)，一般以酶的活力單位為觀(guān)察指標(biāo)。
酶活力是指酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力；酶活力的大小用酶活力單位表示，酶的一個(gè)國(guó)際單位為在 25℃/>下，1分鐘內(nèi)催化1μmol/L底物的酶量，或是轉(zhuǎn)化1微摩爾（1μmol）底物的有關(guān)基團(tuán)的酶量。
測(cè)定酶活力時(shí)，常常用產(chǎn)物的生成量或是底物的消耗量來(lái)計(jì)算。一般以測(cè)定產(chǎn)物增加量為好，因?yàn)楫a(chǎn)物從無(wú)到有，只要方法足夠靈敏就可以準(zhǔn)確測(cè)定。
2．測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的方法簡(jiǎn)介 一類(lèi)是分光光度法，另一類(lèi)是比色法。
前者是測(cè)定酶速率的方法，需要紫外 分光光度計(jì) 與酶試劑。后者有金式(King)法，穆氏（Mohum）法與賴(lài)氏（Reitman Frankel）法3種。
這3種方法是目前國(guó)內(nèi)測(cè)定ALT的主要方法，他們的測(cè)定原理、試劑和操作步驟及采用溫度等方面均完全相同，主要不同點(diǎn)為酶與底物的作用時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制方法和單位定義。
在作用時(shí)間上，金氏為60min，其余兩法均為30min。
金氏法的單位是：100ml血清與足量丙氨酸、α-酮戊二酸在pH7.4 37℃/>保溫1h，每生成1μmol丙酮酸，稱(chēng)為一個(gè)丙氨酸氨基 轉(zhuǎn)移酶 活力單位。
穆氏法的單位定義是：每毫升血清在pH7.4， 37℃/>保溫條件下與底物作用30min，每生成2.5μg丙酮酸為一個(gè)單位。
賴(lài)氏法的單位定義是：血清1ml，反應(yīng)總液量3 ml,在 25℃/>、340nm光波下，光徑 1cm/>，1 min使光密度降低0.001為一個(gè)單位。
由于不同方法測(cè)得丙氨酸氨基 轉(zhuǎn)移酶 的活力單位正常值范圍不同，故臨床評(píng)價(jià)其診斷意義時(shí)，必須首先明確是什么活力單位及該法正常值，而后才能對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果作出準(zhǔn)確結(jié)論。
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