血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)活性測定
實驗目的
1．掌握血清丙氨酸氨基轉移酶活性測定的基本原理。
2．了解血清丙氨酸氨基轉移酶的測定方法及臨床意義。
實驗原理
丙氨酸氨基轉移酶(ALT)催化丙氨酸與α—酮戊二酸生成丙酮酸和谷氨酸。
丙酮酸產量的多少，即反應酶活性的大小。
丙酮酸可與2,4—二硝基苯肼在酸性溶液中反應形成相應的2,4-二硝基苯腙，呈黃色，后者在堿性條件下呈紅棕色。
通過測定其在520nm波長處的光吸收來了解丙酮酸的生成量，借此測定血清ALT的活力，故該類方法又稱比色測定法。該法雖然也有缺點，但操作簡便，不需要特殊 儀器 和 試劑 ，故在臨床上被廣泛應用。
該法的單位定義是:每lml血清在pH7.4, 37℃/>保溫條件下與底物作用30分鐘,每生成2.5μg丙酮酸為一個單位。人血清的丙氨酸氨基轉移酶正常值為2～40U。
器材和試劑
1.器材 恒溫水浴、721、722分光光度計、液體混合器、刻度吸量管、滴管、 試管 等
2.試劑
(1) 0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)：稱取無水磷酸二氫鉀（KH 2 PO 4 ） 2.69克/>和磷酸氫二鉀K 2 HPO 4 · 3H 2 O 13.97g/>加蒸餾水溶解后移至1 000ml容量瓶中，校正pH到7.4，然后加蒸餾水至刻度。貯存于冰箱中備用。
(2)丙氨酸氨基轉移酶底物液(pH7.4)：精確稱取DL－丙氨酸 1.78g/>和α—酮戊二酸 29.2g/>，先溶于0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液約50ml中，然后用1mol/L NaOH 校正pH到7.4，再用磷酸緩沖液稀釋到 100ml。充分混勻，冰箱保存，可保存一周。
(3)0.02% 2,4-二硝基苯肼溶液( 1mM/>)：精確稱取2,4-二硝基苯肼20mg溶于1mo1／L鹽酸中，待溶解后用1mo1／L鹽酸稀釋至100ml過濾后使用。
(4) 0.4M/>/L氫氧化鈉溶液。
(5)丙酮酸標準液(500μg/ml)：精確稱取丙酮酸鈉62.5mg溶于0.1mol/LH 2 SO 4 100ml中, 此試劑需現用現配。
操作步驟
1．標準曲線的制作 取干燥潔凈 試管 9支，編號，按下表加入試劑，混勻：
另取干燥潔凈試管11支，編號，在1～9號試管中依次加入上述稀釋的1～9號丙酮酸標準液0.1ml，在10號管中加入未經稀釋的丙酮酸標準液(500μg/ml) 0.1ml,再按下表操作。
各管混勻，于室溫靜置10分鐘，520nm波長，以第11管為空白管比色，讀取各管光密度將各管丙酮酸含量（5－50μg）按下式換算成谷丙轉氨酶活力單位:
以每100ml血清中丙氨酸氨基轉移酶活力單位為橫坐標，光密度為縱坐標繪制標準曲線。
2．酶活性的測定 取干燥潔凈試管2支，標明測定管和對照管，按下表操作。
混勻，靜置10min，用分光光度計，在520nm波長，用 蒸餾 水調節零點，讀取測定管和對照管光密度，以測定管光密度值減去對照管光密度值，然后從標準曲線上查出其酶的活力單位。
注意事項
1．標本應空腹取血，當時進行測定或將分離的血清貯存于冰箱中。
2．酶的測定結果與酶作用時間、溫度、PH及試劑加入量等有關，在操作時均應準確掌握。
3．測定試劑更換時，要重新制作標準曲線。
臨床意義
ALT廣泛存在于一般組織細胞中,肝細胞中此酶含量最多。肝炎、中毒性肝細胞壞死等肝病時，血清中此酶活性增加，其他疾病如心肌梗塞、心肌炎等亦有增高。故血清丙氨酸氨基轉移谷丙轉氨酶活性得測定在臨床診斷上具有重要意義。
附注
1 ． 酶活力的意義及測定方法 研究酶促反應速度和各種因素對酶促反應速度的影響時，一般以酶的活力單位為觀察指標。
酶活力是指酶催化化學反應的能力；酶活力的大小用酶活力單位表示，酶的一個國際單位為在 25℃/>下，1分鐘內催化1μmol/L底物的酶量，或是轉化1微摩爾（1μmol）底物的有關基團的酶量。
測定酶活力時，常常用產物的生成量或是底物的消耗量來計算。一般以測定產物增加量為好，因為產物從無到有，只要方法足夠靈敏就可以準確測定。
2．測定血清丙氨酸氨基轉移酶活性的方法簡介 一類是分光光度法，另一類是比色法。
前者是測定酶速率的方法，需要紫外 分光光度計 與酶試劑。后者有金式(King)法，穆氏（Mohum）法與賴氏（Reitman Frankel）法3種。
這3種方法是目前國內測定ALT的主要方法，他們的測定原理、試劑和操作步驟及采用溫度等方面均完全相同，主要不同點為酶與底物的作用時間、標準曲線繪制方法和單位定義。
在作用時間上，金氏為60min，其余兩法均為30min。
金氏法的單位是：100ml血清與足量丙氨酸、α-酮戊二酸在pH7.4 37℃/>保溫1h，每生成1μmol丙酮酸，稱為一個丙氨酸氨基 轉移酶 活力單位。
穆氏法的單位定義是：每毫升血清在pH7.4， 37℃/>保溫條件下與底物作用30min，每生成2.5μg丙酮酸為一個單位。
賴氏法的單位定義是：血清1ml，反應總液量3 ml,在 25℃/>、340nm光波下，光徑 1cm/>，1 min使光密度降低0.001為一個單位。
由于不同方法測得丙氨酸氨基 轉移酶 的活力單位正常值范圍不同，故臨床評價其診斷意義時，必須首先明確是什么活力單位及該法正常值，而后才能對檢驗結果作出準確結論。
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