擬南芥組織提取RNA及RT-PCR

試劑和器皿

所有試劑都用DEPC水配置，所有器皿都在180℃ 烘8hr或者在雙氧水中泡半小時以上,`所有的離心管和PIPET都用新的。

DEPC 水。

RNA Extraction Buffer: 0.2M    Tris-Cl （Ph 8.0 ），0.4M LiCl ，25mM EDTA ， 1% SDS 。

3M    NaAc pH5.2 。

2M LiCl 。

RNase free 的水飽和酚。

氯仿。

無水乙醇。

70% 乙醇。

DNase(RNase free) 。

冰若干。

研缽和研棒，180℃ 烘8hr。

小棒磨，雙氧水中泡半小時以上。

實驗步驟

1． 小量（如RT-PCR）：新鮮的綠葉或花等組織適量，置于 1.5 ml的離心管中, 蓋緊管蓋，立刻放入液氮中。取出后將1.5 ml離心管放入管內置滿液氮的15ml離心管，保持低溫環境。用小磨棒研磨成粉，加入400 m l RNA Extraction Buffer和400 m l酚，置于冰上。

大量(如NORTHERN)：收集大量的植物組織，用液氮速凍后在研缽中充分研碎，然后將植物組織粉末用新PIPET移入另一個預先加入適量的RNA Extraction Buffer和酚（體積比1：1）的研缽中，混勻后分裝在1.5 ml的離心管中，每管800 m l。

2．劇烈震蕩5次。

3．13200rpm 離心6 min,取上清(建議用酚抽兩次)，移入另一個裝有300 m l氯仿的1.5 ml離心管中，劇烈震蕩。

4．13200rpm 離心6 min，取上清，移入另一個裝有1000 m l無水乙醇和40 m l 3M    NaAc的1.5 ml離心管中，-20℃ 放置20min以上。

5．13200rpm離心10 min,棄上清。

6．70%乙醇洗一次, 13200rpm離心5min,棄上清,超凈臺吹干。

7．加入10-30 m l DEPC水。-20℃ 短期保存,-70℃ 長期存放。

（一般操作至此，如NORTHERN實驗。高質量RNA的獲取可以用以下步驟純化，如RT-PCR實驗。）

8. 加入400 m l 2M LiCl, 盡量溶解。（LiCL可沉淀大分子量的RNA,如果要操作分子量較小的RNA樣品，建議省去這一步）

9．13200rpm離心10 min,棄上清,加入100 m l DEPC水,10 m l 3M NaAc,300 ul無水乙醇,混合均勻,-20℃ 放置20min以上。

10．13200rpm離心10 min, 棄上清。

11．70%乙醇洗一次, 13200rpm離心5 min,棄上清，超凈臺吹干。

12. 對 RNA 定量，取 RNA 用 DNase 處理， 1ugRNA 用 1 單位的 DNase 處理，處理體系不宜過大（ 10-20uL ）。 37 度放置 30min

13. 取部分處理的 RNA ，稀釋至 RT 后準備用做模板擴增的濃度， PCR 驗證是否有 DNA 污染

14. 將體積擴至300 m l（加入DEPC水），加入300 m l酚，劇烈震蕩。

15. 13200rpm 離心6 min，取上清，移入另一個裝有600 m l無水乙醇和30 m l 3M    NaAc的1.5 ml離心管中，-20℃ 放置20min以上。

16．13200rpm離心10 min, 棄上清。

17．70%乙醇洗一次, 13200rpm離心5 min,棄上清，超凈臺吹干

18．溶于10-30 m l DEPC水。電泳定量,（OD定量）。-20℃ 短期保存,-70℃ 長期存放。

（13-18步也可省略，直接進行RT反應）

19. 取適量RNA進行RT反應（參見具體使用的試劑盒）

20. RT反應后，如果未作13-18部，需用酚/氯仿抽提，以去除12步加入的DNase.如做了13-18步，也建議用酚/氯仿抽提一下

21. PCR反應