氨基酸的紙層析的原理和操作方法
一、目的和要求
1.學(xué)習(xí)分配層析的原理和方法。
2.掌握氨基酸紙上層析法的操作技術(shù)（包括點樣、平衡、展層、顯色、鑒定）。
二、原理
層析法又稱色層分離法、色譜法。是一種分離分析多組分混合物質(zhì)的極有效的物理及物理化學(xué)分析方法。
色譜法是目前各種化學(xué)分離法中最重要的一種方法。由于其分離效能高、分離速度快，試樣用量少等特點，已經(jīng)成為在與化學(xué)有關(guān)的一切領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的一種分離技術(shù)
紙層析是以濾紙為載體（惰性支持物）的分配層析。
什么是分配呢？
一般把物質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑之間的溶解過程稱為分配。達到平衡時，兩種溶劑中所溶解的溶質(zhì)的濃度之比稱為分配系數(shù)，又稱平衡常數(shù)。
一個物質(zhì)在某溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)，在一定溫度下是一個常數(shù)。
濾紙纖維與水有較強的親和力，濾紙纖維能吸附25-29%的水分，其中6-7%的水以氫鍵與纖維素的羥基結(jié)合，在通常條件下較穩(wěn)定，不易除去。這種水分組成為固定相。而有機溶劑與濾紙的親和力甚弱，因而有機溶劑為流動相（在纖維間空隙中流動），它沿著濾紙移動。溶劑由下向上移動的，稱上行法；由上向下移動，稱下行法。
將樣品在濾紙上（此點稱為原點）進行展層，樣品中的各種溶質(zhì)（如各種氨基酸）即在兩相溶劑中不斷進行分配。由于它們的分配系數(shù)不同，不同溶質(zhì)隨流動相移動的速率不等，于是就將這些溶質(zhì)分離開來，形成距原點不等的層析點。
溶質(zhì)在濾紙上移動的速率用Rf值表示：
原點到層析點中心的距離
Rf= ————————————
原點到溶劑前沿的距離
只要條件（如溫度、展層溶劑的組成、濾紙的質(zhì)量等）不變，Rf值是常數(shù)。故可根據(jù)Rf值作定性分析。
三、 試劑與器材
（一） 試劑
1、酸性展開劑：4份水飽和的正丁醇和1份醋酸的混合物。將20毫升正丁醇和5毫升醋酸放入分液漏斗中，與15毫升水混合，充分震蕩，靜止后分層，放出下層水層。取擴展劑倒入培養(yǎng)皿中備用。
2、顯色劑：0.1%茚三酮顯色液：稱取0.1g茚三酮，溶于100ml正丁醇中。
3、未知氨基酸溶液
4、標準氨基酸溶液。
（二）器材
1、毛細管。
2、標本缸。
3、新華濾紙一號。（如果濾紙不干凈，可用0.4mol/LHCL浸包20小時或過夜后，用 蒸餾 水洗至中性，再用95%乙醇沖洗，晾干后用。）
4、噴霧器。
5、培養(yǎng)皿。
6、分液漏斗。
7、電吹風(fēng)。
四、操作
1、層析濾紙的準備
在15cm×20cm的濾紙上一端距邊緣3cm處用鉛筆輕輕劃一條直線，在此直線上每間隔3cm做一記號。
2、點樣：用毛細管將各 氨基酸 樣品分別點在這四個位置上；每點完一次后，吹干再點第二次。點的直徑應(yīng)小于0.5cm，每點共點三到四次。
3、平衡與展開
將濾紙縫成圓筒形（注意紙的二邊不相碰），掛在層析缸蓋內(nèi)的鉤上，蓋好蓋子飽和20～30min。然后將濾紙筒放入盛有展開劑的培養(yǎng)皿中（點樣的一端在下，展開劑的液面需低于點樣線1cm），待溶劑前沿上升到離頂端1cm時取出，吹干至無正丁醇氣味為止,用鉛筆畫出溶劑前沿界線。
4、顯色：用0.1%茚三酮溶液均勻噴霧顯色，65℃烘干或吹干即可顯出各種 氨基酸 的層析斑點。
五、定性鑒定
計算各種氨基酸的R f 值，與各種氨基酸的標準Rf值（25±1℃）見主要參考書1的p49表2-4）對照鑒定是什么氨基酸。
六、注意事項
1、 濾紙 要保持清潔，操作時勿用手接觸，載手套或只拿邊角。
點樣斑點要盡量小，最大不超過0.5cm的直徑，每次點樣后用冷風(fēng)吹干再點第二次。
2、展開時點樣點不要浸入有機溶劑中，至少要平衡半小時或1~2小時。
3、顯色時噴霧要均勻小點，不均勻會將斑點（溶質(zhì)）沖下來。
4、溶劑必須新鮮配制并搖勻才能使用。
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