細(xì)胞增殖生長(zhǎng)方面實(shí)驗(yàn)-細(xì)胞計(jì)數(shù)法

原理

細(xì)胞計(jì)數(shù)法：細(xì)胞計(jì)數(shù)法是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)增長(zhǎng)數(shù)值常用最簡(jiǎn)便的方法。一般過(guò)程為接種21 孔/24 孔板細(xì)胞（如用培養(yǎng)瓶時(shí)則21 瓶）。分7 組，每組3 孔（或瓶），培養(yǎng)一周，期間逐日檢測(cè)一組，計(jì)數(shù)。把7天中的細(xì)胞數(shù)值繪成圖，即為細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

材料與儀器

細(xì)胞
胰蛋白酶
培養(yǎng)瓶 恒溫箱 試管 細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)器

步驟

1.  懸液制備
取待測(cè)生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞，增長(zhǎng)至接近匯合時(shí)，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加1 ml 0.25 %胰蛋白酶液，37 ℃溫箱中消化，至細(xì)胞接近脫離瓶壁前吸出消化液、加新的培養(yǎng)液、輕吹打制備成細(xì)懸液、計(jì)數(shù)；

2.  接種
向每孔中接種等量細(xì)胞，置溫箱中培養(yǎng)；把培養(yǎng)瓶中營(yíng)養(yǎng)液倒入試管中并記錄下毫升量；

3.  計(jì)數(shù)檢測(cè)
從次日起，即開(kāi)始檢測(cè)第一組每個(gè)孔（或瓶）中的細(xì)胞總數(shù)，用計(jì)算盤(pán)或用細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，取3 個(gè)孔的均值，如此至第7 組結(jié)束；

4.  繪圖
用座標(biāo)圖紙繪成生長(zhǎng)曲線。

注意事項(xiàng)

1.  計(jì)數(shù)法簡(jiǎn)便易行，但不夠精確，約有20 %～30 %的誤差。為提高準(zhǔn)確性，每孔也應(yīng)計(jì)算2～3 次，則總和每組計(jì)算總次數(shù)達(dá)6 次～12 次，均值可能更為精確。

2.  細(xì)胞數(shù)量增加 1 倍的時(shí)間稱(chēng)倍增時(shí)間，亦可從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線中測(cè)知。

常見(jiàn)問(wèn)題

細(xì)胞增殖生長(zhǎng)力是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，有多種顯示方法，除實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞計(jì)數(shù)法之外，還可以進(jìn)行細(xì)胞分裂指數(shù)的測(cè)定。細(xì)胞分裂是細(xì)胞增殖的方式，能比較確切地反映細(xì)胞增殖度。細(xì)胞分指數(shù)是指被測(cè)細(xì)胞群每 1000 個(gè)細(xì)胞中的分裂細(xì)胞數(shù)(分裂細(xì)胞/1000)，用以表示細(xì)胞增殖旺盛程度。因此在檢測(cè)中需觀察和記錄群體中 1000 個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞分裂相數(shù)。

細(xì)胞被制成分散的懸液后，以低密度(2～5 個(gè)細(xì)胞/cm2)被接種到底物上，貼壁并能存活生長(zhǎng)形成細(xì)胞小群(克隆)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)值稱(chēng)接種存活率，用以表示細(xì)胞群的活力。由于檢測(cè)接種存活率時(shí)是借觀察克隆(通常為 16～50 個(gè)細(xì)胞)形成情況，又因每個(gè)克隆都來(lái)自一個(gè)細(xì)胞，因此也稱(chēng)克隆形成率。細(xì)胞接種存活率與細(xì)胞活力成正比。

近年流式光度儀的發(fā)展已成為檢測(cè)細(xì)胞增殖周期主要手段，可進(jìn)行多項(xiàng)柱測(cè)，如細(xì)胞周期時(shí)相、DNA 合成強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間等，效果極好，已取代了應(yīng)用同位素等繁瑣方法。培養(yǎng)細(xì)胞是非常適用于做流式細(xì)胞儀檢測(cè)的對(duì)象，程序簡(jiǎn)單、怏速、效果準(zhǔn)確。流式細(xì)胞儀除能檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相變化和反應(yīng) DNA 合成情況外，也可借以了解染色體倍性；另外尚可結(jié)合熒光免疫法對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行分析等。

來(lái)源《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》（北京出版社）