血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳
【 實驗目的】
1.進一步掌握電泳的基本原理及凝膠電泳 的原理。
2.熟悉瓊脂 糖凝膠電泳的特點和操作要點。
3.掌握正常人血漿脂蛋白的分類。
【 實驗原理】
瓊脂 糖凝膠電泳的原理：瓊脂糖凝膠是由D-半乳糖和3，6脫水L-半乳糖的殘基通過氫鍵交替排列組成的直鏈多糖。電泳時，因為凝膠中含水量大（98%～99%），固體支持物的影響較少，故電泳速度快、區帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團，電滲影響很小，是一種良好的電泳材料，分離效果較好。
血清中脂類物質均與載脂蛋白結合成水溶性脂蛋白形式存在。各種脂蛋白所含載脂蛋白的種類及數量不同，因而不同脂蛋白顆粒大小相差很大。因此，以瓊脂 糖凝膠為支持物，在電場中可使各種脂蛋白顆粒分開。
瓊脂糖凝膠電泳分離血清脂蛋白方法簡單。將血清脂蛋白用脂類染料蘇丹黑（或油紅等）進行預染。再將預染過的血清置于瓊脂糖凝膠板上進行分離。
通電后，可以看到脂蛋白被分成三條區帶，從負極到正極依次為β脂蛋白（最深）、前β脂蛋白（最淺）及α脂蛋白（比前β脂蛋白略深），在原點處應無乳糜微粒。此法應用于高脂蛋白血癥的分型，可將血清脂蛋白分為幾種不同的類型，為不同類型的高脂蛋白血癥、冠心病、高血壓以及心肌梗死的臨床診斷提供生化指標。
【 器材和試劑】
1.器材 電泳儀、電泳槽、離心機、水浴鍋、染色盤、 微量注射器、濾紙、鑷子及剪刀、2cm/>′8cm/>玻璃片
2.試劑
(1)巴比妥緩沖液(pH8.6):稱取巴比妥鈉15.4g/>、巴比妥2.76g/>及EDTA0.29g/>，加水溶解后，再加蒸餾水定溶至1 000ml（pH為8.6，離子強度0.075），作為電極緩沖液。
(2)蘇丹黑染色液:將蘇丹黑0.5g/>溶于無水乙醇5ml中至飽和。
(3)凝膠緩沖液:稱取三羥甲基甲烷(Tris)1.212g/>,EDTA0.29g/>及NaCl5.85g/>,用蒸餾水溶解后，稀釋至1 000ml，調pH至8.6。
(4)瓊脂糖凝膠:稱取瓊脂糖0.50g/>溶于50ml凝膠緩沖液中，再加水50ml，在水浴中加熱至沸，待瓊脂糖完全溶解后，立即停止加熱。
(5)新鮮血清(無溶血現象)。
【 操作步驟】
1．預染血清 血清0.2ml加蘇丹黑染色液0.02ml于試管中，混和后置37℃/>水浴染色30min，然后離心(2 000r／min)約5min。
2．制備瓊脂糖凝膠板 已配制的0.5％瓊脂糖凝膠于沸水浴(或微波爐)中加熱融化，用10ml吸管吸取約3ml凝膠溶液澆注在載玻片上，靜置約半小時后凝固(天熱時需延長，可放冰箱數分鐘加速凝固)。
3. 點加預染血清 在已凝固的瓊脂糖凝膠板距一端的2cm/>處，用自制打孔器(在小玻璃片的兩面固定兩片小膠片)垂直打入凝膠后立即取出，然后用膠片剝出長方小條凝膠。用小片濾紙吸干小槽中的水分，注意不要損壞槽邊緣的凝膠。最后，再用微量注射器吸取經過預染的血清約20m/>l注入凝膠板上的小槽內。
4.電泳 將加過血清的凝膠板平行放于電泳槽中，樣品放于負極一端。用兩層濾紙或紗布于巴比妥緩沖液浸濕，然后輕輕緊密貼在凝膠板兩端,紗布的另一端浸于電泳槽內的巴比妥緩沖液中,接通電源，電壓為100～120V，每片電流為3～4mA，約經電泳40～60min，可見分離脂蛋白色帶。
【 注意事項】
1.預染血清與溫度有關，低溫著色慢，高溫著色快，37℃/>較為適宜。
2.澆注瓊脂糖凝膠板要盡量使厚薄均一，否則會影響脂蛋白的分離效果。
3.將凝膠板放入電泳槽中，應切記與電力線平行、樣品端置負極、搭橋濾紙不能搭在樣品上。
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