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 血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳
發布日期:2022-06-28 08:31:03

 

血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳



【 實驗目的】


1.進一步掌握電泳的基本原理及凝膠電泳 的原理。


2.熟悉瓊脂 糖凝膠電泳的特點和操作要點。


3.掌握正常人血漿脂蛋白的分類。


【 實驗原理】


瓊脂 糖凝膠電泳的原理:瓊脂糖凝膠是由D-半乳糖和3,6脫水L-半乳糖的殘基通過氫鍵交替排列組成的直鏈多糖。電泳時,因為凝膠中含水量大(98%~99%),固體支持物的影響較少,故電泳速度快、區帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團,電滲影響很小,是一種良好的電泳材料,分離效果較好。


血清中脂類物質均與載脂蛋白結合成水溶性脂蛋白形式存在。各種脂蛋白所含載脂蛋白的種類及數量不同,因而不同脂蛋白顆粒大小相差很大。因此,以瓊脂 糖凝膠為支持物,在電場中可使各種脂蛋白顆粒分開。


瓊脂糖凝膠電泳分離血清脂蛋白方法簡單。將血清脂蛋白用脂類染料蘇丹黑(或油紅等)進行預染。再將預染過的血清置于瓊脂糖凝膠板上進行分離。

通電后,可以看到脂蛋白被分成三條區帶,從負極到正極依次為β脂蛋白(最深)、前β脂蛋白(最淺)及α脂蛋白(比前β脂蛋白略深),在原點處應無乳糜微粒。此法應用于高脂蛋白血癥的分型,可將血清脂蛋白分為幾種不同的類型,為不同類型的高脂蛋白血癥、冠心病、高血壓以及心肌梗死的臨床診斷提供生化指標。


【 器材和試劑


1.器材 電泳儀、電泳槽、離心機、水浴鍋、染色盤、 微量注射器、濾紙、鑷子及剪刀、2cm/>′8cm/>玻璃片


2.試劑


(1)巴比妥緩沖液(pH8.6):稱取巴比妥鈉15.4g/>、巴比妥2.76g/>及EDTA0.29g/>,加水溶解后,再加蒸餾水定溶至1 000ml(pH為8.6,離子強度0.075),作為電極緩沖液。


(2)蘇丹黑染色液:將蘇丹黑0.5g/>溶于無水乙醇5ml中至飽和。


(3)凝膠緩沖液:稱取三羥甲基甲烷(Tris)1.212g/>,EDTA0.29g/>及NaCl5.85g/>,用蒸餾水溶解后,稀釋至1 000ml,調pH至8.6。


(4)瓊脂糖凝膠:稱取瓊脂糖0.50g/>溶于50ml凝膠緩沖液中,再加水50ml,在水浴中加熱至沸,待瓊脂糖完全溶解后,立即停止加熱。


(5)新鮮血清(無溶血現象)。


【 操作步驟】


1.預染血清 血清0.2ml加蘇丹黑染色液0.02ml于試管中,混和后置37℃/>水浴染色30min,然后離心(2 000r/min)約5min。


2.制備瓊脂糖凝膠板 已配制的0.5%瓊脂糖凝膠于沸水浴(或微波爐)中加熱融化,用10ml吸管吸取約3ml凝膠溶液澆注在載玻片上,靜置約半小時后凝固(天熱時需延長,可放冰箱數分鐘加速凝固)。


3. 點加預染血清 在已凝固的瓊脂糖凝膠板距一端的2cm/>處,用自制打孔器(在小玻璃片的兩面固定兩片小膠片)垂直打入凝膠后立即取出,然后用膠片剝出長方小條凝膠。用小片濾紙吸干小槽中的水分,注意不要損壞槽邊緣的凝膠。最后,再用微量注射器吸取經過預染的血清約20m/>l注入凝膠板上的小槽內。


4.電泳 將加過血清的凝膠板平行放于電泳槽中,樣品放于負極一端。用兩層濾紙或紗布于巴比妥緩沖液浸濕,然后輕輕緊密貼在凝膠板兩端,紗布的另一端浸于電泳槽內的巴比妥緩沖液中,接通電源,電壓為100~120V,每片電流為3~4mA,約經電泳40~60min,可見分離脂蛋白色帶。


【 注意事項】


1.預染血清與溫度有關,低溫著色慢,高溫著色快,37℃/>較為適宜。


2.澆注瓊脂糖凝膠板要盡量使厚薄均一,否則會影響脂蛋白的分離效果。


3.將凝膠板放入電泳槽中,應切記與電力線平行、樣品端置負極、搭橋濾紙不能搭在樣品上。





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