定磷法測定核酸的含量
【 實驗目的 】
掌握定磷法測定核酸含量的原理和方法
【 實驗原理 】
核酸分子結構中含有一定比例的磷(RNA含磷量約為8.5%~9.0%，DNA含磷量約為9.2%)，測定其含磷量即可求出核酸的量。
核酸分子中的有機磷經強酸消化后形成無機磷，在酸性條件下,無機磷與鉬酸銨結合形成黃色磷鉬酸銨沉淀，其反應為：
在還原劑存在的情況下,黃色物質變成藍黑色,稱為鉬藍。在一定濃度范圍內，藍色的深淺與磷含量成正比，可用比色法測定。若樣品中尚含有無機磷，需作對照測定，消除無機磷的影響，以提高準確性。
【 實驗材料 】
1.實驗器材
恒溫水浴,721分光光度計
2.實驗 試劑
（1）標準磷溶液：將磷酸二氫鉀于110℃烘至恒重，準確稱取0.8775g溶于少量蒸餾水中，轉移至500ml容量瓶中，加入5ml 5mol／L硫酸溶液及氯仿數滴，用蒸餾水稀釋至刻度。此溶液每1m1含磷400μg，臨用時準確稀釋20倍(20μg／m1)。
（2）定磷 試劑
① 17％硫酸：17m1濃硫酸(相對密度l.84)緩緩加入到83m1水中。
②2.5％鉬酸銨溶液：2.5g鉬酸銨溶于100ml水。
③10％抗壞血酸溶液：10g抗壞血酸溶于100ml水，并貯存于棕色瓶中，溶液呈淡黃色尚可使用，呈深黃甚至棕色即失效。
臨用時將上述三種溶液與水按如下比例混合：溶液(1):溶液(2): 溶液(3):水=1:1:1:2(V: V)
（3）5%氨水, 27%硫酸
【 實驗操作 】
1．磷標準曲線的繪制
取干燥 試管 7支編號，按表所示加入試劑。
試劑 | 管號 | ||||||
0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
磷標準溶液，ml | 0.0 | 0.05 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
蒸餾水，ml | 3.0 | 2.95 | 0.9 | 2.8 | 0.7 | 2.6 | 2.5 |
定磷試劑，ml | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 |
A 660 | |||||||
加畢搖勻，在45℃水浴中保溫10min，冷卻，以零號管調零點，于660nm處測吸光度。以磷含量為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖。
2．總磷的測定
稱粗核酸0.1g，用少量水溶解(若不溶，可滴加5%氨水至pH7.0)，待全部溶解后，移至50ml容量瓶中，加水至刻度(此溶液含樣品2mg/m1)，即配成核酸溶液。
吸取上述核酸溶液1.0ml，置大 試管 中，加入2.5m1 27%硫酸及一粒玻璃珠，于通風櫥內直火加熱至溶液透明(切勿燒干)，表示消化完成。
冷卻后取下，將消化液移入100ml容量瓶中，以少量蒸餾水洗滌試管兩次，洗滌液一并倒入容量瓶，再加蒸溜水至刻度，混勻后吸取3m1溶液置試管中，加3m1定磷試劑，45℃ 水浴 保溫10min后取出, 測A 660 。
3．無機磷的測定
吸取核酸溶液1ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取3.0ml置試管中，加定磷試劑3.0m1，45℃ 水浴 中保溫10min后取出, 測A 660 。
4．結果處理
總磷A 660 －無機磷A 660 =有機磷A 660
從標準曲線上查出有機磷微克數(X)，按下式計算樣品中核酸百分含量
【 實驗結果討論 】
定磷法即可以測定DNA的含量又可以測定RNA的含量，若DNA中混有RNA或RNA中混有DNA，都會影響結果的準確性。
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