蛋白質(zhì)的性質(zhì)與鑒定
蛋白質(zhì)(protein)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生物體最重要的生物大分子之一，所有的生命活動都離不開蛋白質(zhì)。對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能的研究是生命科學(xué)的核心問題。認(rèn)識蛋白質(zhì)要首先從了解蛋白質(zhì)的性質(zhì)入手，并進(jìn)一步掌握利用蛋白質(zhì)的性質(zhì)對樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和分離的技術(shù)。本實驗主要介紹對樣品中是否含有蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定以及蛋白質(zhì)沉淀分離的基本方法。
一、蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)
蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)是指利用蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或某些特殊基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)，與一些化學(xué) 試劑 發(fā)生反應(yīng)，生成有色物質(zhì)而呈現(xiàn)不同顏色的反應(yīng)。不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，其氨基酸的種類和含量也不同，因此其呈色反應(yīng)的特征也不同。利用蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)的強(qiáng)度和特征的差異，可對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。
【實驗?zāi)康摹?/span>
學(xué)習(xí)和了解常用的幾種鑒定蛋白質(zhì)與氨基酸的方法，進(jìn)一步認(rèn)識氨基酸是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位。
【實驗內(nèi)容】
（一）雙縮脲反應(yīng)
【實驗原理】
當(dāng)加熱至 180℃左右時，兩分子尿素縮合脫去一分子氨，生成雙縮脲。
雙縮脲反應(yīng)是指在堿性條件下，雙縮脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)與二價銅離子作用，生成紫紅色配合物的反應(yīng)。在肽和蛋白質(zhì)分子中具有肽鍵(-CO-NH-)，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲類似，也能發(fā)生此反應(yīng)，生成藍(lán)紫色或紫紅色的配合物，且呈色強(qiáng)度在一定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故常用于蛋白質(zhì)的定性或定量測定。
凡分子中含二個或二個以上酰胺基(-CO-NH2)，或與此相似的基團(tuán)，如-CH2-NH2，-CS-NH2，-C(NH)NH2的任何化合物，無論這類基團(tuán)直接相連，還是通過一個碳或氮原子間接相連，均可發(fā)生上述反應(yīng)，并且該反應(yīng)的干擾因素較多。NH3對此反應(yīng)具有嚴(yán)重的干擾，因為NH3與銅離子可生成深藍(lán)色的銅氨配合物。應(yīng)當(dāng)注意，蛋白質(zhì)和多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。
【器材和 試劑 】
1. 器材 酒精燈，試管等。
2. 試劑
（1）1∶10雞蛋白溶液。
（2）10%NaOH溶液。
（3）1％CuSO4。
（4）尿素。
【操作步驟】
1．取小試管一支，加1∶10雞蛋白液2滴、10％NaOH溶液5滴及1％硫酸銅溶液1滴，混勻后，呈紫紅色的雙縮脲反應(yīng)。
2．另取小試管1支，加小匙尿素，小火加熱至熔，試嗅其氣味。繼續(xù)加熱使之凝固，這固體是什么？加水15滴使熔，然后加10％NaOH 5滴，1％硫酸銅1滴，可見什么現(xiàn)象？
（二）茚三酮反應(yīng)
【實驗原理】
凡含有自由氨基的化合物與茚三酮共熱時，可生成藍(lán)紫色物質(zhì)，此反應(yīng)茚三酮反應(yīng)。伯氨化合物、NH3和α-氨基酸及一切蛋白質(zhì)能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。但脯氨酸、羥脯氨酸氧化時不能放出NH3和茚三酮反應(yīng)生成黃色物質(zhì)。在定性或定量測定 生物 樣品中的α-氨基酸及蛋白質(zhì)時，應(yīng)嚴(yán)防伯氨化合物和能釋放出NH3的干擾物的存在。
α-氨基酸及蛋白質(zhì)的茚三酮反應(yīng)分二步進(jìn)行，首先是氨基酸被氧化，產(chǎn)生 CO2和醛，而水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所生成之還原型茚三酮與另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。此反應(yīng)的適宜pH為5～7，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。該反應(yīng)十分靈敏，1∶1 500 000濃度的氨基酸水溶液即能顯示反應(yīng)，因此是一種常用的氨基酸定量方法。
【器材和試劑】
1．1∶10雞蛋白溶液
2．0.1%茚三酮乙醇溶液
3．0.25%丙氨酸溶液：稱取丙氨酸0.25g，加水100ml
【操作步驟】
1．取小試管1只，加1∶10雞蛋白溶液4滴、蒸餾水10滴、0.1％茚三酮乙醇溶液6滴，混勻，于沸水浴中加熱約1min，室溫冷卻后，即成粉紅色，以后慢慢變成紫色或藍(lán)色。
2．取小試管1支，加丙氨酸4滴重復(fù)上述操作，觀察結(jié)果。
二、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)
親水膠體在水中的穩(wěn)定因素有兩個：即同種電荷和溶劑化膜。蛋白質(zhì)是高分子化合物，其分子大小在1～100nm，蛋白質(zhì)分子的-COOH、-NH2和-OH都是親水基團(tuán)，因此，蛋白質(zhì)是親水膠體。蛋白質(zhì)在體液中的穩(wěn)定存在對 生物 非常重要。 在水溶液中，蛋白質(zhì)表面的親水基團(tuán)與極性水分子相互作用形成水化膜，同時蛋白質(zhì)分子本身帶有電荷，與溶液的反離子作用，形成雙電層，削弱了蛋白質(zhì)分子之間的吸附力，因而每個蛋白質(zhì)分子可形成一個穩(wěn)定的膠粒。整個蛋白質(zhì)溶液就形成穩(wěn)定的親水溶膠體系。蛋白質(zhì)分子表面極性基團(tuán)越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大。
在一定物理化學(xué)因素影響下，蛋白質(zhì)分子失去水化膜或失去電荷，就喪失了穩(wěn)定因素，即以固態(tài)形式從溶液中析出，這種作用稱為蛋白質(zhì)的沉淀作用。
沉淀法操作簡便，成本低廉，不僅用于實驗室中，也用于某些生產(chǎn)目的的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時最常用的方法。根據(jù)沉淀作用的結(jié)果，可將蛋白質(zhì)的沉淀作用分為兩類：
（1）可逆沉淀作用：在發(fā)生沉淀作用時，雖然蛋白質(zhì)已經(jīng)沉淀析出，然而其分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)并沒發(fā)生明顯的改變，仍保持原有的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。如除去沉淀因素，蛋白質(zhì)可重新溶解。因此，這種沉淀作用稱為可逆沉淀作用。屬于此類的有鹽析作用，低溫下丙酮、乙醇使蛋白質(zhì)沉淀的作用，以及利用等電點的沉淀等。
（2）不可逆沉淀作用：在發(fā)生沉淀反應(yīng)時，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)型遭到破壞，失去原來的天然性質(zhì)，這時蛋白質(zhì)已發(fā)生變性。這種變性蛋白質(zhì)的沉淀不能再溶解于原來溶劑中，稱為不可逆沉淀反應(yīng)。重金屬鹽、生物堿試劑、過酸、過堿、加熱、震蕩、超聲波、有機(jī)溶劑等都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀反應(yīng)。
【實驗?zāi)康摹?/span>
1. 通過實驗加深對蛋白質(zhì)溶液的溶膠特性及其穩(wěn)定因素的認(rèn)識。
2. 了解各種沉淀試劑使蛋白質(zhì)沉淀的本質(zhì)，區(qū)分可逆的鹽析沉淀及不可逆的沉淀作用。
【實驗內(nèi)容】
(一)蛋白質(zhì)的鹽析作用
【實驗原理】
用大量中性鹽使蛋白質(zhì)從溶液中析出的過程稱為蛋白質(zhì)的鹽析作用或中性鹽沉淀。
蛋白質(zhì)是親水膠體，在高濃度的中性鹽影響下，蛋白質(zhì)分子被鹽脫去水化層，同時蛋白質(zhì)分子所帶的電荷被中和，結(jié)果蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性遭受破壞而沉淀析出。中性鹽并不破壞蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，因此，析出的蛋白質(zhì)仍保持其天然蛋白的性質(zhì)，若除去中性鹽或減低鹽的濃度時，還能重新溶解。
沉淀不同的蛋白質(zhì)所需中性鹽的濃度不同，而鹽類不同也有差異。例如：加硫酸銨至飽和，則清蛋白沉淀析出；加硫酸銨至半飽和，則球蛋白沉淀析出。向含有清蛋白和球蛋白的雞蛋清溶液中加硫酸鎂或氯化鈉至飽和，則球蛋白沉淀析出。所以在不同條件下，用不同濃度的鹽類可將各種蛋白質(zhì)從混合溶液中分別沉淀析出，該法稱為蛋白質(zhì)的分級鹽析。目前，蛋白質(zhì)的鹽析作用在各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化、生產(chǎn)、科研工作和臨床化驗等工作中廣泛應(yīng)用。
【器材和試劑】
1．1∶10雞蛋白溶液。
2．飽和硫酸銨溶液：稱取377g硫酸氨溶于500ml 20℃的水中。可稱取過量的硫酸氨，加熱助溶，冷卻后，應(yīng)有晶體析出。
3．固體硫酸銨
【操作步驟】
1．取5ml雞蛋白溶液于 試管 中，加入等量飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置20min后，則球蛋白全部析出。
2．過濾，收集透明濾液，濾液中含有清蛋白，若濾液渾濁，須繼續(xù)過濾至透明為止。
3．向1ml清濾液中加固體硫酸銨約0.5g，邊加邊振搖，直至達(dá)到飽和，溶液出現(xiàn)渾濁，再向渾濁液加1.5～2.0ml水，觀察結(jié)果。
（二）生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)
【實驗原理】
植物體內(nèi)具有顯著生理作用的含氮堿性化合物稱為生物堿 (或植物堿)。能沉淀生物堿或與其產(chǎn)生顏色反應(yīng)的物質(zhì)稱為生物堿試劑，如鞣酸、苦味酸、磷鎢酸等。蛋白質(zhì)在水溶液中是酸堿兩性電解質(zhì)，蛋白質(zhì)溶液的pH值小于等電點時，蛋白質(zhì)分子的堿性基團(tuán)帶有較多的正電荷，它能與生物堿試劑中的負(fù)電荷結(jié)合形成不溶物而沉淀。生物堿試劑以及三氯乙酸、磺基水楊酸，在血液與尿液分析時都很重要，進(jìn)行血液化學(xué)成分滴定時，常用作去除蛋白質(zhì)的試劑，以消除蛋白質(zhì)對測定的干擾。
【器材和試劑】
1．1∶10雞蛋白溶液。
2．10%HCl溶液。
3．10%NaOH溶液。
4．10%磺基水楊酸溶液。
【操作步驟】
（1）取 試管 1支，加入1∶10雞蛋白溶液1ml、10%HCl1滴，混勻，再加入10％磺基水楊酸溶液2滴。
（2）另觀察兩管蛋白質(zhì)的沉淀。
（三）重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)
【實驗原理】
蛋白質(zhì)溶液的pH值大于等電點時，蛋白質(zhì)分子的酸性基團(tuán)帶有較多的負(fù)電荷，易與帶正電荷的重金屬鹽類Cu２＋ 、Ag＋ 、Pb２＋ 和Hg２＋ 等結(jié)合成穩(wěn)定的沉淀而析出。
在有機(jī)體內(nèi)，蛋白質(zhì)常以其可溶性的鈉鹽或鉀鹽的形式存在；當(dāng)加入汞、鉛、銅、銀等重金屬鹽時；則蛋白質(zhì)形成不溶性的鹽類而沉淀。經(jīng)過這種處理后的蛋白質(zhì)沉淀不再溶解于水中，說明它已發(fā)生了變性。
重金屬鹽類沉淀蛋白質(zhì)的反應(yīng)通常很完全，特別是在堿金屬鹽類存在時。因此，生化分析中，常用重金屬鹽除去體液中的蛋白質(zhì)；臨床上用蛋白質(zhì)解除重金屬鹽的食物性中毒。但應(yīng)注意，使用乙酸鉛或硫酸銅沉淀蛋白質(zhì)時，試劑不可加過量，否則可使沉淀出的蛋白質(zhì)重新溶解。
【器材和試劑】
1．1∶10雞蛋白溶液。
2．10%NaOH溶液。
3．0.5％硫酸鋅溶液。
4．3％硝酸銀溶液。
5．0.5％乙酸鉛溶液。
6．0.1％硫酸銅溶液。
【操作步驟】
1．取1支試管，加入1∶10雞蛋白溶液1ml、10%NaOH 1滴，混勻，再加入0.5％硫酸鋅6滴，觀察結(jié)果。0.5％乙酸鉛
2．取試管3支，各加入約1m1蛋白質(zhì)溶液，分別加入3％硝酸銀3～4滴，0.5％乙酸鉛1～3滴和0.1％硫酸銅3～4滴，觀察沉淀的生成。第1支試管的沉淀留作透析用，然后向第2、3支試管再分別加人過量的乙酸鉛和飽和硫酸銅溶液，觀察沉淀的再溶解。
（四）加熱沉淀蛋白質(zhì)
【實驗原理】
由于溫度升高，破壞了蛋白質(zhì)的次級鍵，會引起蛋白質(zhì)的變性。幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，變成不可逆的不溶狀態(tài)。鹽類和pH對蛋白質(zhì)加熱凝固有重要影響。少量鹽類促進(jìn)蛋白質(zhì)的加熱凝固。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點時，不帶電荷，加熱凝固最完全、最迅速。在過酸或過堿溶液中，蛋白質(zhì)分子帶有正電荷或負(fù)電荷，雖變性也不會凝固沉淀。在冷卻后，調(diào)節(jié)pH達(dá)到蛋白質(zhì)的等電點，則有沉淀析出。若同時有足量的中性鹽存在，則蛋白質(zhì)可因加熱而凝固。
【器材和試劑】
1．1∶10雞蛋白溶液。
2．0.1%乙酸溶液。
3．10%乙酸溶液。
4．飽和NaCl溶液。
5．10%NaOH溶液。
【操作步驟】
取5支試管、編號，按下表加入有關(guān)試劑(單位：滴)：
試劑管號 | 1∶10雞蛋白 | 0.1%乙酸 | 10%乙酸 | 飽和NaCl | 10%NaOH | 蒸餾水 |
1 2 3 4 5 | 10 10 10 10 10 | — 5 — — — | — — 5 5 — | — — — 2 — | — — — — 2 | 7 2 2 — 5 |
1．將各管混勻，觀察記錄各管現(xiàn)象后，放入沸 水浴 中加熱10min，注意觀察比較各管的沉淀情況。然后，將第3、4、5號管分別用10％NaOH或10％乙酸中和，觀察并解釋實驗結(jié)果。
2．3、4、5號管繼續(xù)分別加入過量的酸或堿，觀察它們發(fā)生的現(xiàn)象；然后，用過量的酸或堿中和第3、5號管，沸 水浴 加熱10min。
觀察沉淀變化檢查這種沉淀是否溶于過量的酸或堿中，并解釋實驗結(jié)果。
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