胰蛋白酶活性測定的方法與步驟
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在動物胰臟中，胰蛋白酶是以無活性的酶原狀態存在的。在生理條件下，胰蛋白酶原隨胰液分泌至十二指腸后，在小腸上腔有Ca2 的環境中，為腸激酶或胰蛋白酶所激活，其肽鏈N-端的賴氨酸與異亮氨酸之間的一個肽鍵被水解，失去一個酸性6肽，其分子 構象發生一定的改變后轉變為具有催化蛋白質水解活性的胰蛋白酶。
胰蛋白酶原分子 量約為24000，其等電點為pH8.9;胰蛋白酶的分子量約為23400，其等電點為pH10.8。
胰蛋白酶在pH3.0時最穩定，其濃溶液可貯存于冰箱(0℃以下)數周而活性無顯著喪失。pH<3時，胰蛋白酶易變性。PH>5時，胰蛋白酶易自溶。胰蛋白酶催化活性的最適pH為7.6～7.8。
重金屬離子、有機磷化合物和反應產物都能抑制胰蛋白酶的活性。胰臟、卵清和大豆中也含有一些蛋白質對胰蛋白酶活性 具有抑制作用。
胰蛋白酶能催化蛋白質的水解，對于由堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸)的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的肽鍵具有高度的專一性。此外，胰蛋白酶也能催化由堿性氨基酸的羧基所形成的酰胺鍵和酯鍵，有高度的專一性仍表現為對堿性氨基酸羧基一側的選擇對此等化學鍵的催化水解活性的敏感度為：酯鍵>酰胺鍵>肽鍵。因此，可以利用含有這些化學鍵中任一種鍵型的底物來研究胰蛋白酶的專一催化活性。
本實驗方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯作為底物，水解反應如下：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)在波長253nm下的紫外光吸收遠遠弱于N-苯甲酰-L-精氨酸的紫外光吸收。在胰蛋白酶的催化下，BAEE隨著酯鍵的水解，水解產物BA逐漸增多，反應體系的紫外光吸收亦隨之相應增加，以△A253nm計算胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶的BAEE單位定義為：以BAEE為底物，在一定反應條件下，每分鐘使△A253nm增加0.001的酶量為一個BAEE單位。
本實驗方法二采用以酪蛋白為底物的方法來測定胰蛋白酶活性。以酪蛋白為底物，主要用于測定胰蛋白酶粗制品的活力。胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯醋酸沉淀的小分子 肽以及氨基酸。在一定濃度范圍內，酶的水解濾液在波長275nm處光吸收的增值與胰蛋白酶的活力單位成正比。測定中以標準酪氨酸溶液的光吸收作對照，根據活力單位的定義，確定樣品中胰蛋白酶的活性。活力單位的定義：在一定條件下，每分鐘酶水解濾液光吸收的增值與1μmol酪氨酸在275nm處光吸收值相同時的酶量為一個蛋白酶活力單位(U)。
1、試劑
(1)1.0mmol/LBAEE底物溶液
(2)10mmol/LHCl
(3)0.1mol/L、pH8.0硼酸鹽緩沖液
(4)10mg/mL酪蛋白溶液
取酪蛋白1g，加13mL0.1mol/LNaOH、蒸餾水40mL，置60℃水浴加熱至溶解，放至室溫后，加水稀釋調pH至8.0并定容至100mL。
(5)5%三氯乙酸溶液
(6)0.2mol/L鹽酸溶液
(7)50μg/mL酪蛋白對照溶液
精確稱取經105℃干燥至恒重的酪氨酸5mg，用0.2mol/L鹽酸定容至100mL。
2、器材
(1)恒溫水浴
(2)紫外分光光度計
(3)離心機
(4)試管
[方法和步驟]
1、N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)測定法：
取2個光程為1cm的帶蓋石英比色杯，分別加入25℃預熱過的2.8mL 1.0mmol/L BAEE底物溶液。向一個比色杯內加入0.2mL10mmol/L HCl，作為空白，在波長253nm下調節儀器零點;向另一個比色杯中加入0.2mL待測酶液，立即蓋上蓋迅速混勻計時，每半分鐘讀數一次，共讀3～4min。測得的結果要使△A253nm/min控制在0.05～0.100之間為宜。若偏離此范圍則要適當增減酶量。
以時間(t)為橫坐標，光吸收值( A253nm)為縱坐標作圖，在直線部分任選一個時間間隔與相應的光吸收值變化(△A253nm)，按以下公式計算胰蛋白酶的活力單位。
2、酪蛋白為底物測定法
(1)取3支試管，1～3編號。
取試管1，加入1.0mL 酶液，加用0.1mol/L、pH8.0硼酸鹽緩沖液2.0mL，在水浴保溫10min，精確加入40℃預熱的10mg/mL酪蛋白溶液5.0mL，混勻，立即置于40℃水浴中，準確反應30min后，加入5.0mL的5%三氯乙酸，迅速搖勻。
取試管2，加入1.0mL 酶液，加用0.1mol/L，pH8.0硼酸鹽緩沖液2.0mL，在40℃水浴保溫10min，精確加入5.0mL 5%三氯乙酸，搖勻，在40℃水浴保溫30min后，再加10mg/mL酪蛋白溶液5.0mL，混勻。
取試管3，分別加入5.0mL 5%三氯乙酸和8.0mL 0.1mol/L(pH8.0)硼酸緩沖液，混合。
將上述三試管溶液于3 500r/min離心10min，分別取上清液。
以試管3離心上清液作參比，在紫外分光光度計中波長275nm處測定試管1和試管2離心上清液的光吸收值(A275)。
(1)酪氨酸對照液的測定
以0.2mol/L鹽酸溶液作參比，在波長275nm處測定酪氨酸對照溶液的光吸收值(AS)。
[結果計算]
式中 A —— 試管1測得的光吸收值;
A0 —— 試管2測得的光吸收值;
AS ——酪氨酸對照溶液的光吸收值;
C對照 ——酪氨酸的濃度(μg/ mL);
M對照 ——酪氨酸的分子量(181.19);
V總 ——反應總體積(mL);
V樣品 ——加入的樣液體積(mL);
t ——反應時間(min);
n——樣品的稀釋倍數。
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