枯草桿菌蛋白酶活力的測定原理與實驗步驟
實驗目的
1.加深了解酶活力的概念。
2.學習掌握測定蛋白酶活力的方法。
實驗原理
酶活力指酶催化某一特定反應的能力。其大小可用在一定條件下酶催化反應進行一定時間后，反應體系中底物的減少量或產物的生成量來表示。
酶活力單位是表示酶活力大小的重要指標。本實驗規定酶活力單位(U)為一定條件下每分鐘分解1μg 酪氨酸所需的酶量。
實驗選用枯草桿菌蛋白酶水解酪蛋白產生酪氨酸的反應體系。產物酪氨酸在堿性條件下與Folin-酚試劑反應生成藍色化合物，該藍色化合物在680nm 處有最大光吸收，其吸光值與酪氨酸含量呈正比。
因此通過測定一定條件下產物酪氨酸的含量變化，可計算出蛋白酶的活力。
儀器和試劑
儀器:
恒溫水浴鍋、分光光度計 、試管及試管架、干燥濾紙、玻璃漏斗。
原料
枯草桿菌蛋白酶：稱取1g 枯草桿菌蛋白酶粉，用少量0.02mol/L，pH7.5磷酸緩沖液 溶解并定容至100mL，震蕩15分鐘，使充分溶解，干紗布過濾，取濾液冰箱備用。使用時視酶活力高低用緩沖液適當稀釋。
試劑
1. Folin-酚試劑：
在2L 磨口回流瓶中加入鎢酸鈉(Na2WoO4 . 2H2O)100g，鉬酸鈉(Na2WoO4 . 2H2O)25g，蒸餾水700mL，85%磷酸50mL 以及濃鹽酸100mL，充分混勻后，微火回流加熱10小時。再加入硫酸鋰150g，蒸餾水50mL 和液溴數滴，搖勻后開口繼續煮沸15min，以驅趕過剩的溴。冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，過濾，溶液呈黃綠色，置于棕色試劑瓶中暗處貯藏。使用前用標準NaOH 溶液、酚酞為指示劑標定酸度(約為2mol/L)，然后加水稀釋至1mol/L，即可使用。
2. 0.2mol/L 鹽酸溶液
3. 0.04mol/L 氫氧化鈉溶液
4. 0.55mol/L 碳酸鈉溶液
5. 10%三氯乙酸溶液
6. 0.02mol/LpH7.5磷酸緩沖液 ：
稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液);稱取磷酸二氫鈉(Na2HPO4 .12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。取A 液84mL，B 液16mL 混合后，得到0.2mol/LpH7.5磷酸緩沖液 ，可長期存放。臨用時稀釋10倍即可。
7. 標準酪氨酸溶液(50μg/mL)：稱取12.5mg 以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2mol/L 鹽酸約30mL 溶解后，蒸餾水定容至250mL。
8. 酪蛋白溶液(0.5%)：稱取1.25g 酪蛋白，用0.04mol/L 氫氧化鈉溶液(20mL)溶解，再用0.02mol/LpH7.5磷酸緩沖液 定容到250mL。
操作步驟
(一)酪氨酸標準曲線的制作
取6支試管(標號0，1~5)，按順序分別加入0.00，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00mL 標準酪氨酸溶液，再用水補足到1.00mL，搖勻后各加入0.55mol/L 碳酸鈉5.0mL，搖勻。依次加入Folin—酚試劑1.00mL，搖勻并計時，于30℃水浴鍋中保溫15min。然后680nm 處測定吸光值(以0號管作對照)。以酪氨酸含量(μg)作橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。
(二)酶活力測定
1.酶反應：取一支試管，加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，于30℃水浴中預熱5分鐘，再加入1.0mL已預熱好的枯草桿菌蛋白酶液，立即計時，水浴中準確保溫10min，從水浴中取出后，立即加入2.0mL的10%三氯醋酸溶液，搖勻靜置數分鐘，干濾紙過濾，收集濾液(樣品液)。另取一試管，先加入1.0mL 已預熱好的枯草桿菌蛋白酶液和2.0mL 的10%三氯醋酸溶液，搖勻，放置數分鐘，再加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，然后于30℃水浴保溫10min，同樣干濾紙過濾，收集濾液(對照液)。
以上兩過程，應各做一次平行實驗。
2.濾液中酪氨酸含量的測定
取3支試管，分別加入1.0mL 水、A 液、B 液，然后各加入5.0 mL 0.55mol/L 碳酸鈉溶液和1.00mLFolin-酚試劑，搖勻按標準曲線制作方法保溫并測吸光度值。根據吸光度值，由標準曲線查出A、B 液中酪氨酸含量差值，即可推算出酶的活力單位。
五、計算
A 樣品—樣品液的吸光度值
A 對照—對照液的吸光度值
K—標準曲線上A=1時對應的酪氨酸μg 數
V—酶促反應液的體積(本實驗為5mL)
T—酶促反應時間(本實驗為10min)
N—酶溶液稀釋倍數
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