血清蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳
【 實驗目的 】
1.掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理。
2.熟悉聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作過程。
3.了解聚丙烯酰胺凝膠電泳的特點和應用范圍。
【實驗原理】
1．聚丙烯酰胺凝膠的聚合原理 聚丙烯酰胺凝膠(PAG)是一種人工合成的凝膠，由丙烯酰胺（Acrylamide簡寫為Acr）和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺（N，N1-methylene-bisacrylamide，簡寫Bis）在催化劑（過硫酸胺或核黃素）的作用下，聚合成含有酰胺基側鏈的脂肪族長鏈，相鄰的兩個鏈通過甲叉橋交聯形成就具有三維網狀結構的聚丙烯酰胺凝膠。為了加速聚合，在合成凝膠時還加入四甲基乙二胺作為加速劑。
聚丙烯酰胺凝膠具有三維網狀結構，能起分子篩作用。用它作電泳支持物，對樣品的分離不僅取決于各組分所帶電荷的多少，也與分子大小有關。凝膠網孔的大小主要受成膠物的總濃度及Acr和Bis的比例的影響。一般電泳采用成膠物質總濃度為7.5%，此濃度稱為標準凝膠濃度。如果改變總膠濃度，也應相應改變Acr和Bis的比例。
2．不連續聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳的原理 根據凝膠各部分緩沖液的種類及pH值，孔徑大小是否相同等，可分為連續系統和不連續系統聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。連續系統是指電泳槽內緩沖液的pH值與凝膠中的相同，不連續系統則不同。
不連續圓盤電泳一般是在小玻璃管內進行的。把三種性質不完全一樣的聚丙烯酰胺凝膠重疊起來。上層為樣品膠，中間為濃縮膠，這兩層膠的凝膠濃度為3%是大孔膠，應用Tris-HCl緩沖液，其pH6.7。
下層是分離膠，此層凝膠總濃度為7.5%，是小孔膠，也用Tris-HCl緩沖液，pH8.9。上下電泳槽緩沖液是Tris-甘氨酸緩沖液，pH=8.3。由于凝膠的孔徑和緩沖液的pH值不同，產生濃縮效應、電荷效應和分子篩效應，使電泳的靈敏度、分辨率提高。
（1）濃縮效應：無論哪種電泳方式，要想得到良好的分離效果，電泳開始前必須使樣品中各種成分同處于同一起跑線上。樣品加入后顆粒分散，不能從同一起點開始電泳，但樣品通過濃縮膠被濃縮成高濃度的樣品薄層，使顆粒同時開始電泳。
其機理是樣品膠及濃縮膠的Tris-HCl緩沖液pH=6.7，電泳時，HCl全部電離為Cl - ，而電泳槽內Tris-甘氨酸緩沖液pH=8.3，甘氨酸等電點pI=6.0，電泳時，甘氨酸僅極少部分電離為甘氨酸負離子（Gly - ），一般血清蛋白質點約pI=5.0，也解離為蛋白質負離子（Pr - ），其解離度比HCl小，比甘氨酸大。
通電后，這三種離子同時向正極泳動，有效泳動率是Cl - ＞Pr - ＞Gly - ，電泳時開始時，Cl - 泳動最快（稱快離子），很快超過Pr - ，泳動到最前面，Gly - 泳動最慢（稱慢離子），泳動到最后，Pr - 介于其間，被濃縮成一個狹小的樣品薄層。
這種濃縮作用可使蛋白質濃縮數百倍。血清蛋白在紙上電泳和醋酸纖維素薄膜電泳上僅可分成5～7個組分。而在聚丙烯酰胺凝膠電泳上則可以分為20～30個成分。
（2）電荷效應：蛋白質樣品在界面處被濃縮成一狹窄的樣品薄層，進入分離膠。由于各種蛋白質分子的等電點不同，在同一pH的緩沖液中所帶有效電荷不同，因而泳動率也不同，因此各種蛋白質就按泳動率快慢順序排列成一個一個圓盤狀的蛋白質區帶。
（3）分子篩效應：各種蛋白質分子由于分子大小和構象不同，因而通過一定孔徑的分離膠時所受的摩擦力不同，受阻滯的程度不同，表現的泳動率的不同而被分開。即使蛋白質所帶的凈電荷相似，也會由于分子篩效應被分開。
【器材和試劑 】
1． 器材 電泳儀、圓盤電泳槽、微量加樣器、注射器、50ml小燒杯
2． 試劑
（1）30%丙烯酰胺儲存液：丙烯酰胺 30.0g/>，甲叉雙丙烯酰胺 0.8g/>，加水至100ml，棕色瓶 4℃/>保存。
（2）催化劑（10％過硫酸銨）：過硫酸銨 1g/> 加水至10ml，臨用前現配。
（3）加速劑：四甲基乙二胺 (TEMED）
（4）分離膠緩沖液（pH8.8）：取三羥甲基氨基甲烷（Tris ） 36.3g/>，加入1 mol /L HCl 48ml ，再加蒸餾水至100ml， 4℃/>保存。
（5）濃縮膠緩沖液（pH6.8）：取 6.0g/> Tris，用1 mol /L HCl 48 ml，再加蒸餾水至1000ml， 4℃/>保存。
（6）電泳緩沖液（pH8.3）：取 28.8g/>甘氨酸， 6.0g/> Tris，分別溶解后，加蒸餾水到100ml ， 4℃/>保存。
(7)染色液：考馬斯亮藍R-250 0.46g/>、甲醇（可用無水乙醇代替）110ml、28ml冰乙酸，TritonX-100 1ml,溶解后補足水至總體積400ml。
（8）脫色液（30%甲醇、7%乙酸）：甲醇（可用無水乙醇代替）110ml，冰乙酸28ml，TritonX-100 8ml,補足水至400ml。
（9）保存液 : 7%冰醋酸。
（10）樣品稀釋液：濃縮膠緩沖液25 ml加入蔗糖 10g/>及0.05％溴酚藍5ml，最后加水至100ml。
【操作步驟】
1．凝膠柱的制備
（1）取兩端已有金鋼砂磨平的 10cm/>× 0.6cm/> 的玻璃管。在距一端 7cm/>和 7.5cm/>處，各劃一條線。插入橡皮墊中，垂直安放于 試管 架中。
（2）按下表配制分離膠，迅速用滴管將其沿管壁加入玻璃管內，至 7 cm/>畫線處。
分離膠(ml) | 濃縮膠(ml) | |
30%丙烯酰胺 | 2.50 | 1.00 |
分離膠緩沖液(pH8.8) | 1.25 | — |
濃縮膠緩沖液(pH6.8) | — | 1.25 |
蒸餾水 | 6.20 | 7.65 |
TEMED | 0.05 | 0.05 |
10%過硫酸銨 | 0.05 | 0.05 |
總體積 | 10 | 10 |
丙烯酰胺濃度（g%） | 7.5 | 3.0 |
（3）隨即用5ml注射器經針頭沿玻璃管壁加入蒸餾水約 0.5cm/>高度，加水時要緩慢，盡量減少凝膠表面的震動與混合。靜置，待凝膠聚合后(約20min)，去除水相，然后用吸水紙吸干殘余的液體。
（4）按上表配制濃縮膠，立即用滴管沿凝膠管壁加至 7.5cm/>處，并隨即沿管壁緩慢加入蒸餾水約 0.5cm/>高度，靜置20分鐘。
2．樣品配制 正常入血清0.3ml，加入樣品稀釋液1.7ml，輕搖混勻。
3．電泳
（1）將上述制備好的凝膠管分別插入上電泳槽的橡膠塞孔中，高出槽底。
（2）下電泳槽加入10倍稀釋的電泳緩沖液，隨后放入帶凝膠管的上電泳槽。
（3）加樣：用微量注射器取樣品液加30μl ，沿管壁慢慢加在濃縮膠面上，再用緩沖液沿管壁緩慢加在樣品液上（防止與樣品液混合稀釋），直到加滿玻璃管，在電泳槽先加入少量緩沖液，檢查一下是否漏水，如不漏水，加入適量緩沖液，然后將帶電極的蓋放好。
（4）電冰：將上層電極糟的電極接在電泳儀的負極、下層電極糟的電極接在電泳儀的正極、接好電源。調節電流為lmA /管。待示蹤劑進入分離膠時，調節電流為3mA/管。當示蹤劑移至距玻璃管下口時，停止電泳。
4．剝膠 取下凝膠管，用帶有 10cm/> 長針頭的注射器，內裝蒸餾水做潤滑劑，沿管壁插入管內，邊注入水邊旋轉玻璃管。直至膠柱與管壁分開。然后用吸耳球輕輕在膠管的一端加壓，使凝膠從玻璃管中緩慢滑出。
5．固定 將膠柱移入12.5%的三氯乙酸溶液中，固定10min。向裝有凝膠柱的 試管 中加入染色液，
6.染色與脫色 將固定后的凝膠柱移入染色液， 60℃/> 水浴 中染色10～20min，隨后移入脫色液中， 60℃/>脫色30～60min。
7.保存 將脫色后的凝膠柱移入7%冰乙酸溶液中，密封保存，觀察結果, 記錄 血清 蛋白質經聚丙烯酰胺凝膠電泳可分多少區帶。
【注意事項】
1．Acr和Bis都是神經性毒劑，對皮膚有刺激作用、但在形成凝膠后則無毒，操作時應盡量避免接觸皮膚，并注意洗手。
2．蛋白加樣量要合適。加樣量太少，條帶不清晰；加樣量太多則泳道超載，條帶過寬而重疊，甚至覆蓋至相鄰泳道。
3．過硫酸銨的主要作用是提供自由基引發丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合反應，故一定要新鮮，貯存過久的過硫酸銨商品不能使用。此外，10%過硫酸銨必須現用現配， 4℃/>冰箱貯存不超過48h。
4.灌制凝膠時，應避免產生汽泡，因為汽泡會影響電泳分離效果。
5.剛灌注分離膠混合溶液后，應在分離膠液面上加1～ 2cm/>高的水層，以阻隔空氣。膠液面上加水層時要特別小心，緩緩疊加，以免沖壞凝膠的膠面。
【思考題】
1．電泳時，為什么要把上層電泳槽接在負極上？
2. 使聚丙烯酰胺凝膠具有高分辨率的三個因素是什么?
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