血清蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳
【 實驗?zāi)康?】
1.掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理。
2.熟悉聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作過程。
3.了解聚丙烯酰胺凝膠電泳的特點和應(yīng)用范圍。
【實驗原理】
1．聚丙烯酰胺凝膠的聚合原理 聚丙烯酰胺凝膠(PAG)是一種人工合成的凝膠，由丙烯酰胺（Acrylamide簡寫為Acr）和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（N，N1-methylene-bisacrylamide，簡寫B(tài)is）在催化劑（過硫酸胺或核黃素）的作用下，聚合成含有酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長鏈，相鄰的兩個鏈通過甲叉橋交聯(lián)形成就具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚丙烯酰胺凝膠。為了加速聚合，在合成凝膠時還加入四甲基乙二胺作為加速劑。
聚丙烯酰胺凝膠具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能起分子篩作用。用它作電泳支持物，對樣品的分離不僅取決于各組分所帶電荷的多少，也與分子大小有關(guān)。凝膠網(wǎng)孔的大小主要受成膠物的總濃度及Acr和Bis的比例的影響。一般電泳采用成膠物質(zhì)總濃度為7.5%，此濃度稱為標(biāo)準(zhǔn)凝膠濃度。如果改變總膠濃度，也應(yīng)相應(yīng)改變Acr和Bis的比例。
2．不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳的原理 根據(jù)凝膠各部分緩沖液的種類及pH值，孔徑大小是否相同等，可分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。連續(xù)系統(tǒng)是指電泳槽內(nèi)緩沖液的pH值與凝膠中的相同，不連續(xù)系統(tǒng)則不同。
不連續(xù)圓盤電泳一般是在小玻璃管內(nèi)進(jìn)行的。把三種性質(zhì)不完全一樣的聚丙烯酰胺凝膠重疊起來。上層為樣品膠，中間為濃縮膠，這兩層膠的凝膠濃度為3%是大孔膠，應(yīng)用Tris-HCl緩沖液，其pH6.7。
下層是分離膠，此層凝膠總濃度為7.5%，是小孔膠，也用Tris-HCl緩沖液，pH8.9。上下電泳槽緩沖液是Tris-甘氨酸緩沖液，pH=8.3。由于凝膠的孔徑和緩沖液的pH值不同，產(chǎn)生濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，使電泳的靈敏度、分辨率提高。
（1）濃縮效應(yīng)：無論哪種電泳方式，要想得到良好的分離效果，電泳開始前必須使樣品中各種成分同處于同一起跑線上。樣品加入后顆粒分散，不能從同一起點開始電泳，但樣品通過濃縮膠被濃縮成高濃度的樣品薄層，使顆粒同時開始電泳。
其機(jī)理是樣品膠及濃縮膠的Tris-HCl緩沖液pH=6.7，電泳時，HCl全部電離為Cl - ，而電泳槽內(nèi)Tris-甘氨酸緩沖液pH=8.3，甘氨酸等電點pI=6.0，電泳時，甘氨酸僅極少部分電離為甘氨酸負(fù)離子（Gly - ），一般血清蛋白質(zhì)點約pI=5.0，也解離為蛋白質(zhì)負(fù)離子（Pr - ），其解離度比HCl小，比甘氨酸大。
通電后，這三種離子同時向正極泳動，有效泳動率是Cl - ＞Pr - ＞Gly - ，電泳時開始時，Cl - 泳動最快（稱快離子），很快超過Pr - ，泳動到最前面，Gly - 泳動最慢（稱慢離子），泳動到最后，Pr - 介于其間，被濃縮成一個狹小的樣品薄層。
這種濃縮作用可使蛋白質(zhì)濃縮數(shù)百倍。血清蛋白在紙上電泳和醋酸纖維素薄膜電泳上僅可分成5～7個組分。而在聚丙烯酰胺凝膠電泳上則可以分為20～30個成分。
（2）電荷效應(yīng)：蛋白質(zhì)樣品在界面處被濃縮成一狹窄的樣品薄層，進(jìn)入分離膠。由于各種蛋白質(zhì)分子的等電點不同，在同一pH的緩沖液中所帶有效電荷不同，因而泳動率也不同，因此各種蛋白質(zhì)就按泳動率快慢順序排列成一個一個圓盤狀的蛋白質(zhì)區(qū)帶。
（3）分子篩效應(yīng)：各種蛋白質(zhì)分子由于分子大小和構(gòu)象不同，因而通過一定孔徑的分離膠時所受的摩擦力不同，受阻滯的程度不同，表現(xiàn)的泳動率的不同而被分開。即使蛋白質(zhì)所帶的凈電荷相似，也會由于分子篩效應(yīng)被分開。
【器材和試劑 】
1． 器材 電泳儀、圓盤電泳槽、微量加樣器、注射器、50ml小燒杯
2． 試劑
（1）30%丙烯酰胺儲存液：丙烯酰胺 30.0g/>，甲叉雙丙烯酰胺 0.8g/>，加水至100ml，棕色瓶 4℃/>保存。
（2）催化劑（10％過硫酸銨）：過硫酸銨 1g/> 加水至10ml，臨用前現(xiàn)配。
（3）加速劑：四甲基乙二胺 (TEMED）
（4）分離膠緩沖液（pH8.8）：取三羥甲基氨基甲烷（Tris ） 36.3g/>，加入1 mol /L HCl 48ml ，再加蒸餾水至100ml， 4℃/>保存。
（5）濃縮膠緩沖液（pH6.8）：取 6.0g/> Tris，用1 mol /L HCl 48 ml，再加蒸餾水至1000ml， 4℃/>保存。
（6）電泳緩沖液（pH8.3）：取 28.8g/>甘氨酸， 6.0g/> Tris，分別溶解后，加蒸餾水到100ml ， 4℃/>保存。
(7)染色液：考馬斯亮藍(lán)R-250 0.46g/>、甲醇（可用無水乙醇代替）110ml、28ml冰乙酸，TritonX-100 1ml,溶解后補(bǔ)足水至總體積400ml。
（8）脫色液（30%甲醇、7%乙酸）：甲醇（可用無水乙醇代替）110ml，冰乙酸28ml，TritonX-100 8ml,補(bǔ)足水至400ml。
（9）保存液 : 7%冰醋酸。
（10）樣品稀釋液：濃縮膠緩沖液25 ml加入蔗糖 10g/>及0.05％溴酚藍(lán)5ml，最后加水至100ml。
【操作步驟】
1．凝膠柱的制備
（1）取兩端已有金鋼砂磨平的 10cm/>× 0.6cm/> 的玻璃管。在距一端 7cm/>和 7.5cm/>處，各劃一條線。插入橡皮墊中，垂直安放于 試管 架中。
（2）按下表配制分離膠，迅速用滴管將其沿管壁加入玻璃管內(nèi)，至 7 cm/>畫線處。
分離膠(ml) | 濃縮膠(ml) | |
30%丙烯酰胺 | 2.50 | 1.00 |
分離膠緩沖液(pH8.8) | 1.25 | — |
濃縮膠緩沖液(pH6.8) | — | 1.25 |
蒸餾水 | 6.20 | 7.65 |
TEMED | 0.05 | 0.05 |
10%過硫酸銨 | 0.05 | 0.05 |
總體積 | 10 | 10 |
丙烯酰胺濃度（g%） | 7.5 | 3.0 |
（3）隨即用5ml注射器經(jīng)針頭沿玻璃管壁加入蒸餾水約 0.5cm/>高度，加水時要緩慢，盡量減少凝膠表面的震動與混合。靜置，待凝膠聚合后(約20min)，去除水相，然后用吸水紙吸干殘余的液體。
（4）按上表配制濃縮膠，立即用滴管沿凝膠管壁加至 7.5cm/>處，并隨即沿管壁緩慢加入蒸餾水約 0.5cm/>高度，靜置20分鐘。
2．樣品配制 正常入血清0.3ml，加入樣品稀釋液1.7ml，輕搖混勻。
3．電泳
（1）將上述制備好的凝膠管分別插入上電泳槽的橡膠塞孔中，高出槽底。
（2）下電泳槽加入10倍稀釋的電泳緩沖液，隨后放入帶凝膠管的上電泳槽。
（3）加樣：用微量注射器取樣品液加30μl ，沿管壁慢慢加在濃縮膠面上，再用緩沖液沿管壁緩慢加在樣品液上（防止與樣品液混合稀釋），直到加滿玻璃管，在電泳槽先加入少量緩沖液，檢查一下是否漏水，如不漏水，加入適量緩沖液，然后將帶電極的蓋放好。
（4）電冰：將上層電極糟的電極接在電泳儀的負(fù)極、下層電極糟的電極接在電泳儀的正極、接好電源。調(diào)節(jié)電流為lmA /管。待示蹤劑進(jìn)入分離膠時，調(diào)節(jié)電流為3mA/管。當(dāng)示蹤劑移至距玻璃管下口時，停止電泳。
4．剝膠 取下凝膠管，用帶有 10cm/> 長針頭的注射器，內(nèi)裝蒸餾水做潤滑劑，沿管壁插入管內(nèi)，邊注入水邊旋轉(zhuǎn)玻璃管。直至膠柱與管壁分開。然后用吸耳球輕輕在膠管的一端加壓，使凝膠從玻璃管中緩慢滑出。
5．固定 將膠柱移入12.5%的三氯乙酸溶液中，固定10min。向裝有凝膠柱的 試管 中加入染色液，
6.染色與脫色 將固定后的凝膠柱移入染色液， 60℃/> 水浴 中染色10～20min，隨后移入脫色液中， 60℃/>脫色30～60min。
7.保存 將脫色后的凝膠柱移入7%冰乙酸溶液中，密封保存，觀察結(jié)果, 記錄 血清 蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳可分多少區(qū)帶。
【注意事項】
1．Acr和Bis都是神經(jīng)性毒劑，對皮膚有刺激作用、但在形成凝膠后則無毒，操作時應(yīng)盡量避免接觸皮膚，并注意洗手。
2．蛋白加樣量要合適。加樣量太少，條帶不清晰；加樣量太多則泳道超載，條帶過寬而重疊，甚至覆蓋至相鄰泳道。
3．過硫酸銨的主要作用是提供自由基引發(fā)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合反應(yīng)，故一定要新鮮，貯存過久的過硫酸銨商品不能使用。此外，10%過硫酸銨必須現(xiàn)用現(xiàn)配， 4℃/>冰箱貯存不超過48h。
4.灌制凝膠時，應(yīng)避免產(chǎn)生汽泡，因為汽泡會影響電泳分離效果。
5.剛灌注分離膠混合溶液后，應(yīng)在分離膠液面上加1～ 2cm/>高的水層，以阻隔空氣。膠液面上加水層時要特別小心，緩緩疊加，以免沖壞凝膠的膠面。
【思考題】
1．電泳時，為什么要把上層電泳槽接在負(fù)極上？
2. 使聚丙烯酰胺凝膠具有高分辨率的三個因素是什么?
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