福林法測定酸性蛋白酶活力

• 解析蛋白酶活性測定 聚焦蛋白酶研究新進展
  
  

1.1原理

福林試劑在堿性條件下可被酚類化合物還原呈藍色反應(鉬藍和鎢藍的混合物)。由于蛋白質分子 中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等)，它使蛋白質及其水解產物呈上述反應，利用這個原理可以測定蛋白酶活力的強弱。

以酪蛋白為作用底物，在一定pH值和溫度下，同酶液反應，經一段時間后加入三氯乙酸，終止酶的反應，并使殘余的酪蛋白質沉淀，同水解產物分開。經過濾后取過濾液(含蛋白質水解產物的三氯乙酸溶液)，用Na2C03堿化，再加入福林試劑使之發色。

藍色反應的強弱與過濾波中蛋白水解產物的量成正比例，而水解產物的量又同酶活力成正比。因此，根據藍色反應的強弱可以計算出蛋白酶的活力。

1.2操作方法

1.2.1 試劑

1.2.1.l福林試劑

于2000ml磨口回流裝置內加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)100g，鉬酸鈉(NaMoO4·2H2O)25g。水700ml，85%的磷酸50ml，濃鹽酸100ml，文火回流10h，加入硫酸鋰(Li2SO4)150g，蒸餾水50ml，混勻取去冷凝器，加入幾滴液體溴，再蒸沸15min，以驅逐殘溴及除去顏色，溶液應呈黃色。若溶液有綠色，需再加數滴液溴，再蒸沸除去，冷卻后定容至1000ml，過濾，置于棕色瓶中保存，此溶液使用時加2倍蒸餾水稀釋。

1.2.1.2 0.4mol/l的TCA溶液

稱取三氯乙酸65.4g，加水定容至1000ml。

1.2.1.3 0.8mol/l的碳酸鈉溶液

稱取無水碳酸鈉84.8g，加水溶解，定容至1000ml。

1.2.1.4 pH值為3.6的醋酸緩沖液

稱取NaAc·3H20 16g與268ml濃度為6mol/l的醋酸溶液混合，稀釋定容至1000ml。

1.2.1.5 2%酪蛋白溶液

稱取干酪索20g，加入0.lmol/l的氫氧化鈉20ml，在水浴中加熱溶解，然后用pH值為3.6的醋酸緩沖液定容至1000ml。該試劑配制后應及時使用，或放入冰箱內保存。

1.2.1.6 100μg/ml酪氨酸溶液

精確稱取在105℃供箱中烘干至值恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入0.lmol/l的鹽酸，使之溶解，加蒸餾水定容至1000ml。該試劑配制后也應及時使用，或放入冰箱內保存。

1.2.2 繪制標準曲線

配制濃度分別為(單位：μg/ml)：0、20、40、60、80、100的酪氨酸溶液，各取lml(做4個平行樣)，加入不同的試管中，再各加入已稀釋的福林試劑lml和0.4mol/l的碳酸鈉5ml，搖勻，置于水浴鍋中，40℃保溫發色20min。

然后在721型分光光度計 上進行比色測定(波長660nm，以濃度為0μg/ml的酪氨酸反應液做空白對照)。

1.2.3 樣品酶活的測定

稱取酶粉5g，充分碾細，加蒸餾水1000ml，在 4O℃水中攪拌3Omin，充分溶出酶蛋白，然后過濾，濾液用0.1mol/lpH值為3.6的醋酸緩沖液稀釋到一定倍數。取稀釋液1ml(做平行樣4個)，40℃水浴預熱2min，再各加入經同樣預熱的酪蛋白1ml，精確保溫10min。

然后立即加入 0.4mol/l三氯醋酸2ml，終止反應。繼續置水浴中保溫20min，使殘余蛋白質沉淀，然后離心分離或過濾。取濾液lml，再加入0.8mol/l碳酸鈉溶液5ml和已稀釋的福林試劑1ml，搖勻保溫發色20min后，進行比色測定。對照標準曲線，計算酪氨酸的釋放量。

l.2.4 酶活計算

蛋白酶活力=A×4×N/10

式中：A——對照標準曲線得出的酪氨酸釋放量;

4--4ml反應液取出1ml;

N--酶粉的稀釋倍數;

10——反應時間10min。

酸性蛋白酶酶活定義：在40℃，每分鐘水解干酪素產生1μg酪氨酸定義為一個蛋白酶活力單位.

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