具體層析方法:紙層析
紙層析是分配層析法的一種,其以濾紙為惰性載體,展層溶劑大多是由水飽和的有機溶劑組成。
濾紙纖維的—OH 基的親水基團可吸附有機溶劑中的水作固定相,有機溶劑作流動相,
當流動相沿濾紙自下向上展開,稱為上行層析;反之,流動相自上向下移動,為下行層析。
紙層析法主要依據混合組分對兩相分配系數的差異而進行分離的,同時也存在著某種程度的吸附作用和離子交換現象。
試樣經層析后在濾紙上形成距原點不等的層析點,可用比移值(Rf)表示各組成成分的位置。
只要實驗條件不變,對于某一樣品成分Rf 值是一個常數,可用于定性分析。由于影響比移值的因素較多,因此一般采用在相同實驗條件下對照物質對比以確定其異同。作為單體鑒別時,試樣所顯主色譜斑點的顏色(或熒光)與位置,應與對照(標準)樣所顯主色的譜斑點或供試品-對照品(1∶1)混合所顯的主色譜斑點相同。作為質量指標(純度)檢查時,可取一定量的試樣,經展開后,按各單體的規定,檢視其所顯雜質色譜斑點的個數或呈色(或熒光)的強度。作為含量測定時,可將色譜斑點剪下洗脫后,再用適宜的方法測定,也可用色譜掃描儀測定。
所用濾紙應質地均勻平整,具有一定機械強度,不含會影響色譜效果的雜質,也不與所用顯色劑起作用,以免影響分離和鑒別效果。必要時可作特殊處理后再用。
(1)上行法
色譜缸一般為圓形或長方形玻璃缸,缸上有磨口玻璃蓋,以便密閉。色譜濾紙一般長約25cm,寬度則視需要而定,必要時可將色譜濾紙卷成筒形。點樣基線距底邊約2.5cm,可先用鉛筆畫出,再用微量 吸管 或微量注射器吸取溶劑,點于點樣基線上,溶液宜分次點加,每次點加后,使其自然干燥、低溫烘干或經溫熱氣流吹干。樣點直徑一般不超過0.5cm,樣點通常應為圓形。色譜缸內加入適量流動相,放置,待流動相蒸氣飽和后,將點樣后的色譜濾紙垂直浸入流動相約0.5cm,流動相即經毛細管作用沿色譜濾紙上升,除另有規定外,一般展開至15cm 后,取出晾干,按規定方法檢視。
色譜可以向一個方向進行,即單向色譜;也可進行雙向色譜,即先向一個方向展開,取出,待流動相完全揮發后,將濾紙轉90°,再用原流動相或另一種流動相進行展。亦可多次展開,連續展或徑向色譜等。
(2)下行法
所用色譜缸同上行法。在近缸頂端有一用支架架起的玻璃槽作為流動相的容器,槽內有一玻璃棒,用以支持色譜濾紙使其自然下垂,避免流動相沿濾紙與溶劑槽之間發生虹吸現象。
取適當的色譜濾紙按纖維長絲方向切成適當大小的紙條,離紙條上端適當的距離(使色譜紙上端能足夠浸入溶劑槽內的流動相中,并使點樣基線能在溶劑槽側的玻璃支持棒下數厘米處)用鉛筆劃一點樣基線,必要時色譜紙下端可切成鋸齒形,以便于流動相滴下。將試樣溶于適當的溶劑中,制成一定濃度的溶劑。用微量 吸管 或微量注射器吸取溶劑,點于點樣基線上,溶液宜分次點加,每次點加后,使其自然干燥、低溫烘干或經溫熱氣流吹干。樣點直徑一般不超過0.5cm,樣點通常應為圓形。將點樣后的色譜 濾紙 上端放在溶劑槽內,并用玻璃棒壓住,使色譜紙通過槽側玻璃支持棒自然下垂,點樣基線在支持棒下數厘米處。色譜開始前,色譜缸內用各單體中所規定的溶劑的蒸氣飽和,一般可在色譜缸底部放一裝有流動相的平皿,或將浸有流動相的 濾紙 條附著在色譜缸的內壁上,放置一定時間,俟溶劑揮發使缸內充滿飽和蒸氣。然后添加流動相,使浸沒溶劑槽內濾紙,流動相即經毛細管作用沿濾紙移動進行展開至規定距離后,取出濾紙,標明流動相前沿位置,待]流動相揮散后按規定方法檢出色譜斑點。
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