血清總膽固醇測定(高鐵-硫酸顯色法)
【 目的要求 】
1. 掌握高鐵-硫酸顯色法測定血清總膽固醇的原理和方法。
2. 了解血清膽固醇的正常值及臨床意義。
【 實驗原理 】
膽固醇（cholesterol）是環戊烷多氫菲的衍生物，它不僅參與血漿蛋白的組成，而且也是細胞的必要結構成分，在神經組織和腎上腺中含量特別豐富，在肝、腎和表皮組織含量也很多。膽固醇是生物膜和神經髓鞘的重要組成部分，是維持生物膜的正常透過能力不可缺少的。
膽固醇還可以轉化成膽汁酸、固醇類激素和維生素D 3 等。膽固醇主要隨膽汁從糞便排出體外。血液中的膽固醇僅有不到20%是從食物中攝取的，其余均由機體自身合成，肝、腸、腎、骨髓及內分泌腺等均是合成場所。
由于血液與組織內的膽固醇經常不斷地交換，因此血清膽固醇水平基本能夠反應膽固醇的攝取、合成及轉送情況。膽固醇與動脈粥樣硬化等有一定聯系，據國外報道體內膽固醇長期偏低，是誘發癌癥的因素之一。
因此，膽固醇的測定是臨床最普遍檢測項目之一。膽固醇在體內以游離膽固醇（free cholesterol,FC）及膽固醇酯（cholesterol ester，CE）兩種形式存在，統稱總膽固醇。
總膽固醇的測定方法目前已超過200種，可分為化學 試劑 比色法、酶分析法、熒光法、氣相和高效液相色譜法等五大類。由于氣相和高效液相色譜法條件高，臨床實驗室最常用的是化學 試劑 法和酶法。
化學試劑法一般包括抽提、皂化、純化、顯色比色四個階段。
化學法測定總膽固醇的比色原理主要分三類：
①與醋酐-硫酸試劑產生藍綠色。膽固醇酯和膽固醇在與醋酐-硫酸反應時呈色深淺不同，因此用這種方法測定結果偏高。
②與高鐵-硫酸試劑產生紫紅色。高鐵-硫酸比色法靈敏度高，顯色穩定，測定精密度好，是臨床檢驗膽固醇推薦方法。但干擾因素多。
③膽固醇與鄰苯二甲醛-硫酸試劑產生穩定的紫紅色。鄰苯二甲醛-硫酸比色法不需要對膽固醇進行抽提而直接進行測定。
酶法是目前常規應用方法，其優點是快速準確、專一性強、樣本用量少、不需抽提，便于自動化分析和批量測定，是中華醫學會檢驗學會推薦的膽固醇測定的常規方法。
高鐵-硫酸顯色法測定血清總膽固醇是用異丙醇為溶劑提取血清膽固醇，向異丙醇膽固醇抽提液中加入高鐵-硫酸顯色劑，膽固醇與顯色劑反應生成穩定的紫紅色化合物，顏色深淺與膽固醇濃度成正比，可進行比色測定。
【器材和試劑】
1.器材 帶塞試管、微量移液器、721分光光度計、快速混勻器、 離心機 、恒溫水浴箱。
2.試劑
（1）異丙醇（AR）
（2）三氯化鐵儲存液：稱取三氯化鐵（FeCl 3 ﹒6H 2 O AR） 0.1g/>，溶于100ml冰醋酸中。
（3）顯色劑：三氯化鐵儲存液與濃硫酸（AR）按1:1體積混合。
（4）5.17mmol/L膽固醇標準儲存液:精確稱取重結晶膽固醇（MW 386.66）200mg，用異丙醇溶解并稀釋至100ml，置冰箱保存。
（5）膽固醇標準溶液：5.17mmol/L膽固醇標準儲存液4ml，移入100ml容量瓶中，加異丙醇至刻度線。
【 操作步驟 】
1.取血清0.1ml，置于帶塞 試管 中，向管底吹入異丙醇2.4ml，沖散血清，使蛋白質沉淀，加塞混勻后置于 60℃/>水浴1～2min。然后，于快速混勻器上混合15s。離心（3000r/min）5min，取抽提液待用。
2.取干燥 試管 3支，分別標記空白管、標準管和測試管，按下表加入試劑。
試管號 | 空白管 | 標準管 | 測試管 |
膽固醇標準液（ml） | — | 1 | — |
抽提液（ml） | — | — | 1 |
異丙醇（ml） | 1 | — | — |
60℃/> 水浴 保溫1min | |||
顯色液（ml） | 3 | 3 | 3 |
60℃/> 水浴 保溫15min |
冷卻后，選用波長540nm以空白管調零進行比色。讀取并記下吸光度。
【計算】
正常值：3.10～5.70mmol/L
【附注】
抽提液與顯色劑混合時產生熱量，發熱程度與顯色深淺有關，故操作時應注意：
１.同一批標本測定時需要同樣口徑及厚度的試管。為了便于快速混合，試管口徑最好大些。
２.沿管壁加入顯色劑，須與異丙醇抽提液分為兩層，然后迅速混合。不可邊加邊搖，否則顯色不完全。
3. 顯色劑必須加一管混合一管，不可加完后一起混合，混合手法也須一致。
【臨床意義】
成人膽固醇的正常值為：1100～2300mg/L（2.82～5.95mmol/L）總膽固醇增高，常見于以下疾病：
１.甲狀腺功能減退、動脈硬化、冠狀動脈粥樣硬化心臟病及高脂血癥等。
２.糖尿病：特別是并發糖尿病昏迷時，幾乎都有總膽固醇升高。
３.慢性腎炎腎病期、腎病綜合癥、類脂性腎病等。
４.膽總管阻塞時，總膽固醇增高且伴有黃疸，但膽固醇與總膽固醇的比值仍正常。
５.長期高脂飲食、精神緊張或女性妊娠期，總膽固醇也可升高。
６.家族性高總膽固醇血癥（低密度脂蛋白受體缺乏），家族性載脂蛋白β缺乏癥、混合性高脂蛋白血癥。
總膽固醇降低見于以下疾病：
１.甲狀腺功能亢進、營養不良、慢性消耗性疾病。
２.家族性無β或低β脂蛋白血癥。
【思考題】
指出目前臨床最常用的 血清 膽固醇的測定方法，并與本實驗方法比較，指出它們的優缺點。
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