SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的相對分子量
一、目的
了解SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理，并學(xué)會用這種方法測定蛋白質(zhì)的相對分子量。
二、原理
聚丙烯酰胺凝膠電泳之所以能將不同的大分子化合物分開，是由于這些大分子化合物所帶電荷的差異和分子大小不同之故，如果將電荷差異這一因素除去或減小到可以忽略不計的程度，這些化合物在凝膠上的遷移率則完全取決于相對分子質(zhì)量。
SDS是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate）的簡稱，它是一種陰離子去污劑，它能按一定比例與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成帶負電荷的復(fù)合物。
其負電荷遠遠超過了蛋白質(zhì)原有的電荷，也就消除或降低了不同蛋白質(zhì)之間原有的電荷差別，這樣就使電泳遷移率只取決于分子大小這一因素，就可根據(jù)標準蛋白質(zhì)的相對分子量的對數(shù)對遷移率所作的標準曲線求得未知蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）可以用圓盤電泳，也可以用垂直平板電泳，本實驗用目前常用的垂直平板電泳，樣品的起點一致，便于比較。
三、 試劑和器材
（一） 試劑
1、凝膠貯備液：丙烯酰胺（Acr）29.2g，亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）0.8g，加重蒸水至100ml.外包錫紙，4℃冰箱保存，30天以內(nèi)使用。
2、分離膠緩沖液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。
18.15 Tris（三羥甲基氨基甲烷），加約80ml重蒸水，用1mol/LHCl調(diào)pH到8.8，用重蒸水稀釋至最終體積為100ml，4℃冰箱保存。
3、 濃縮膠緩沖液：0.5mol/LHCl，pH6.8。
6gTris,加約60ml重蒸水，用1mol/LHCl調(diào)pH至6.8，用重蒸水稀釋至最終體積為100ml，4℃冰箱保存。
4、 10%SDS，室溫保存。
5、 兩類樣品緩沖液：
（1）2倍還原緩沖液（2×reducing buffer）。
0.5mol/L HCl，pH6.82.5 ml
甘油2.0 ml
質(zhì)量濃度10%SDS4.0ml
質(zhì)量濃度0.1%溴酚藍0.5ml
β-巰基乙醇1.0 ml
總體積10 ml
（2）2倍非還原緩沖液（2×non-reducing buffer）。
重蒸水1.0 ml
0.5mol/L HCl，pH6.82.5 ml
甘油2.0 ml
質(zhì)量濃度10%SDS4.0ml
質(zhì)量濃度0.1%溴酚藍0.5ml
總體積10 ml
6、電極緩沖液，pH8.3。
Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水1000ml，4℃冰箱保存。
7、低相對分子質(zhì)量標準蛋白質(zhì)（上海產(chǎn)），開封后溶于200μl重蒸水，加200μl2倍樣品緩沖液（還原緩沖液），分裝20小官，-20℃保存。臨用前沸水浴3～5min其相對分子質(zhì)量（Mr）如下：標準蛋白質(zhì)Mr
兔磷酸化酶B97 400
牛血清白蛋白66 200
兔肌動蛋白43 000
牛碳酸酐酶31 000
胰蛋白酶抑制劑20 100
雞蛋清溶菌酶14 400
8、質(zhì)量濃度為10%過硫酸銨：此溶液需臨用前配制。
9、染色液：0.25g考馬斯亮藍R250，加入91ml50%甲醇，9ml冰醋酸。
10、脫色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸與875 ml重蒸水混合。
11、待測相對分子質(zhì)量的樣品。
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