SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質的相對分子量
一、目的
了解SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理，并學會用這種方法測定蛋白質的相對分子量。
二、原理
聚丙烯酰胺凝膠電泳之所以能將不同的大分子化合物分開，是由于這些大分子化合物所帶電荷的差異和分子大小不同之故，如果將電荷差異這一因素除去或減小到可以忽略不計的程度，這些化合物在凝膠上的遷移率則完全取決于相對分子質量。
SDS是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate）的簡稱，它是一種陰離子去污劑，它能按一定比例與蛋白質分子結合成帶負電荷的復合物。
其負電荷遠遠超過了蛋白質原有的電荷，也就消除或降低了不同蛋白質之間原有的電荷差別，這樣就使電泳遷移率只取決于分子大小這一因素，就可根據標準蛋白質的相對分子量的對數對遷移率所作的標準曲線求得未知蛋白質的相對分子質量。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）可以用圓盤電泳，也可以用垂直平板電泳，本實驗用目前常用的垂直平板電泳，樣品的起點一致，便于比較。
三、 試劑和器材
（一） 試劑
1、凝膠貯備液：丙烯酰胺（Acr）29.2g，亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）0.8g，加重蒸水至100ml.外包錫紙，4℃冰箱保存，30天以內使用。
2、分離膠緩沖液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。
18.15 Tris（三羥甲基氨基甲烷），加約80ml重蒸水，用1mol/LHCl調pH到8.8，用重蒸水稀釋至最終體積為100ml，4℃冰箱保存。
3、 濃縮膠緩沖液：0.5mol/LHCl，pH6.8。
6gTris,加約60ml重蒸水，用1mol/LHCl調pH至6.8，用重蒸水稀釋至最終體積為100ml，4℃冰箱保存。
4、 10%SDS，室溫保存。
5、 兩類樣品緩沖液：
（1）2倍還原緩沖液（2×reducing buffer）。
0.5mol/L HCl，pH6.82.5 ml
甘油2.0 ml
質量濃度10%SDS4.0ml
質量濃度0.1%溴酚藍0.5ml
β-巰基乙醇1.0 ml
總體積10 ml
（2）2倍非還原緩沖液（2×non-reducing buffer）。
重蒸水1.0 ml
0.5mol/L HCl，pH6.82.5 ml
甘油2.0 ml
質量濃度10%SDS4.0ml
質量濃度0.1%溴酚藍0.5ml
總體積10 ml
6、電極緩沖液，pH8.3。
Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水1000ml，4℃冰箱保存。
7、低相對分子質量標準蛋白質（上海產），開封后溶于200μl重蒸水，加200μl2倍樣品緩沖液（還原緩沖液），分裝20小官，-20℃保存。臨用前沸水浴3～5min其相對分子質量（Mr）如下：標準蛋白質Mr
兔磷酸化酶B97 400
牛血清白蛋白66 200
兔肌動蛋白43 000
牛碳酸酐酶31 000
胰蛋白酶抑制劑20 100
雞蛋清溶菌酶14 400
8、質量濃度為10%過硫酸銨：此溶液需臨用前配制。
9、染色液：0.25g考馬斯亮藍R250，加入91ml50%甲醇，9ml冰醋酸。
10、脫色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸與875 ml重蒸水混合。
11、待測相對分子質量的樣品。
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