轉氨作用
實驗目的
1．通過實驗掌握水平方向濾紙層析原理和技術
2．了解轉氨作用過程。
實驗原理
轉氨基作用是由轉氨酶（氨基轉移酶）催化的，在這個反應中，α-氨基酸的氨基與α-酮酸的酮基之間交換，α-氨基酸轉變成相應的α-酮酸，α-酮酸變成新的一種α-氨基酸。轉氨基作用是一種可逆反應。每個轉氨基反應均由專一的轉氨酶所催化，在不同的生物有機體中均有轉氨酶分布。
本實驗是將丙氨酸和α-酮戊二酸與肝勻漿一起水浴反應，肝中的丙氨酸氨基轉移酶（ALT，又稱谷丙轉氨酶GPT）含量豐富，該酶可將丙氨酸的氨基轉移給α-酮戊二酸，產生丙酮酸和谷氨酸。利用圓盤紙層析鑒定谷氨酸的存在，并且驗證組織中的轉氨作用。在肝臟谷丙轉氨酶(GPT)催化的轉氨基作用，反應方程式如下：
實驗材料
1． 實驗器材
培養皿；表面皿；濾紙；勻漿器；試管；試管架；恒溫水浴鍋；毛細管；移液管；噴霧器；剪刀；鉛筆；格尺。
2． 實驗 試劑
⑴ 0.01M pH7.4磷酸緩沖液：0.2MNa 2 HPO 4 溶液81ml, 0.2MNaH 2 P0 4 溶液19ml混勻，蒸餾水稀釋20倍。
⑵ 0.1M丙氨酸溶液：稱取丙氨酸0.891克先溶于少量0.01MpH7.4磷酸緩沖液中，以1MNa0H仔細調節至pH7.4后，用磷酸鹽緩沖液加至100ml。
⑶ 0.01Mａ-酮戊二酸溶液：稱取ａ-酮戊二酸1.461克先溶于少量0.01M pH7.4磷酸緩沖液中，用1M Na0H仔細調節至pH7.4后，用磷酸鹽緩沖液加至100ml。
⑷ 0.1M谷氨酸溶液：稱取谷氨酸0.735克先溶于少量0．01M pH7.4磷酸緩沖液中， 以1MNa0H仔細調節至pH7.4后，用磷酸緩沖液加至100ml。
⑸ 0.2％茚三酮溶液：稱取茚三酮0.2克溶于100ml 95％乙醇中。
(6)層析溶劑：水飽和的苯酚。
實驗操作
1． 肝勻漿的制備：
取新鮮的豬肝5g,加入20m1預冷0.01M pH7.4磷酸緩沖液，用搗碎機迅速成勻漿(1萬轉大約30秒)。兩人一組進行如下的實驗。
2． 轉氨反應：
取干燥大試管二支，分別標明測定管與對照管，按下表進行操作：
試劑 (ml) | 測定管 | 對照管 |
肝勻漿 | 0.5 | 0.5 |
放入沸水中煮5分鐘， 冷卻，搖勻 | ||
0.1M 丙氨酸溶液 | 0.5 | 0.5 |
0.01M α-酮戊二酸溶液 | 0.5 | 0.5 |
0.01 M pH7.4 磷酸緩沖液 | 1.5 | 1.5 |
搖勻，放進37℃水浴保溫50分鐘 | ||
沸水浴中煮5分鐘，終止反應，取出冷卻后搖勻 | ||
取出冷卻后，分別用濾紙過濾或2000rpm離心3～5分鐘，濾液或上清液分別收集到新的干燥小 試管 中。
3. 紙層析：
⑴ 取直徑12cm圓形濾紙一張，通過圓心作兩條2cm相互垂直的線，兩個線的末端作點樣點，分別標定“測定”、“對照”、“谷氨酸”、“丙氨酸”。
⑵ 取4支毛細管，分別吸取測定管溶液、0.1M谷氨酸溶液、對照管溶液、0.1M丙氨酸溶液。在點樣處點樣，注意斑點不可太大，直徑要小于0.3cm。而且每點一滴，吹干后方可再點第二滴，每個樣品可點2～3次。
⑶ 在濾紙圓心處打一小孔(1mm直徑)，另取同類濾紙條(0.5×2.5cm)，下一半剪成須狀，卷成圓筒，如燈芯，從點樣相反的一側插入小孔。
⑷ 將層析溶劑(水飽和酚溶液)放入直徑為3～5cm的干燥表面皿正中，表面皿置于直徑10cm培養皿正中，將濾紙放平在培養皿上，燈芯浸入溶劑中，將另一同樣大小培養皿反蓋上，溶劑沿燈芯上升到濾紙，再向四周擴展，（層析時間大約45～60分鐘）。溶劑前緣距濾紙邊緣約1cm時即可取出，用鉛筆劃出溶劑的邊緣， 烘箱 中干燥之。
⑸ 顯色：將濾紙放在培養皿上，噴0.2%的茚三酮乙醇溶液， 烘箱 中干燥，濾紙上會呈現紫色弧狀條帶。
實驗結果
用鉛筆畫出條帶的邊框，測出表格中的數值，計算R f 值。
測定參數 | 測定樣品 | 谷氨酸 | 丙氨酸 | 對照 |
點樣點到斑紋中心距離 (cm) | ||||
點樣點到溶劑前沿距離 (cm) | ||||
R f 值 |
與已知的標準的 氨基酸 Rf進行對比，指出條帶所對應的 氨基酸 ，并根據結果解釋轉氨作用。
注意事項
1．層析 濾紙 不可用手觸摸，以免有手印。
2．在 濾紙 上劃線時只需用鉛筆，不可用其它筆。
3．烘烤時要注意明火。
4．點樣時毛細管不能交叉污染。
思考
1．如果對照管在沸水中煮的時間不夠充分，會在層析結果中出現什么現象？
2．氨基酸紙上色譜鑒定法操作的關鍵是什么？
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