轉(zhuǎn)氨作用
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 微軟雅黑, "microsoft yahei", 黑體, helvetica, tahoma, arial, sans-serif; font-size: 14px; background-color: rgb(250, 250, 250);">
1．通過(guò)實(shí)驗(yàn)掌握水平方向?yàn)V紙層析原理和技術(shù)
2．了解轉(zhuǎn)氨作用過(guò)程。
實(shí)驗(yàn)原理
轉(zhuǎn)氨基作用是由轉(zhuǎn)氨酶（氨基轉(zhuǎn)移酶）催化的，在這個(gè)反應(yīng)中，α-氨基酸的氨基與α-酮酸的酮基之間交換，α-氨基酸轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的α-酮酸，α-酮酸變成新的一種α-氨基酸。轉(zhuǎn)氨基作用是一種可逆反應(yīng)。每個(gè)轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)均由專一的轉(zhuǎn)氨酶所催化，在不同的生物有機(jī)體中均有轉(zhuǎn)氨酶分布。
本實(shí)驗(yàn)是將丙氨酸和α-酮戊二酸與肝勻漿一起水浴反應(yīng)，肝中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT，又稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶GPT）含量豐富，該酶可將丙氨酸的氨基轉(zhuǎn)移給α-酮戊二酸，產(chǎn)生丙酮酸和谷氨酸。利用圓盤(pán)紙層析鑒定谷氨酸的存在，并且驗(yàn)證組織中的轉(zhuǎn)氨作用。在肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)催化的轉(zhuǎn)氨基作用，反應(yīng)方程式如下：
實(shí)驗(yàn)材料
1． 實(shí)驗(yàn)器材
培養(yǎng)皿；表面皿；濾紙；勻漿器；試管；試管架；恒溫水浴鍋；毛細(xì)管；移液管；噴霧器；剪刀；鉛筆；格尺。
2． 實(shí)驗(yàn) 試劑
⑴ 0.01M pH7.4磷酸緩沖液：0.2MNa 2 HPO 4 溶液81ml, 0.2MNaH 2 P0 4 溶液19ml混勻，蒸餾水稀釋20倍。
⑵ 0.1M丙氨酸溶液：稱取丙氨酸0.891克先溶于少量0.01MpH7.4磷酸緩沖液中，以1MNa0H仔細(xì)調(diào)節(jié)至pH7.4后，用磷酸鹽緩沖液加至100ml。
⑶ 0.01Mａ-酮戊二酸溶液：稱取ａ-酮戊二酸1.461克先溶于少量0.01M pH7.4磷酸緩沖液中，用1M Na0H仔細(xì)調(diào)節(jié)至pH7.4后，用磷酸鹽緩沖液加至100ml。
⑷ 0.1M谷氨酸溶液：稱取谷氨酸0.735克先溶于少量0．01M pH7.4磷酸緩沖液中， 以1MNa0H仔細(xì)調(diào)節(jié)至pH7.4后，用磷酸緩沖液加至100ml。
⑸ 0.2％茚三酮溶液：稱取茚三酮0.2克溶于100ml 95％乙醇中。
(6)層析溶劑：水飽和的苯酚。
實(shí)驗(yàn)操作
1． 肝勻漿的制備：
取新鮮的豬肝5g,加入20m1預(yù)冷0.01M pH7.4磷酸緩沖液，用搗碎機(jī)迅速成勻漿(1萬(wàn)轉(zhuǎn)大約30秒)。兩人一組進(jìn)行如下的實(shí)驗(yàn)。
2． 轉(zhuǎn)氨反應(yīng)：
取干燥大試管二支，分別標(biāo)明測(cè)定管與對(duì)照管，按下表進(jìn)行操作：
試劑 (ml) | 測(cè)定管 | 對(duì)照管 |
肝勻漿 | 0.5 | 0.5 |
放入沸水中煮5分鐘， 冷卻，搖勻 | ||
0.1M 丙氨酸溶液 | 0.5 | 0.5 |
0.01M α-酮戊二酸溶液 | 0.5 | 0.5 |
0.01 M pH7.4 磷酸緩沖液 | 1.5 | 1.5 |
搖勻，放進(jìn)37℃水浴保溫50分鐘 | ||
沸水浴中煮5分鐘，終止反應(yīng)，取出冷卻后搖勻 | ||
取出冷卻后，分別用濾紙過(guò)濾或2000rpm離心3～5分鐘，濾液或上清液分別收集到新的干燥小 試管 中。
3. 紙層析：
⑴ 取直徑12cm圓形濾紙一張，通過(guò)圓心作兩條2cm相互垂直的線，兩個(gè)線的末端作點(diǎn)樣點(diǎn)，分別標(biāo)定“測(cè)定”、“對(duì)照”、“谷氨酸”、“丙氨酸”。
⑵ 取4支毛細(xì)管，分別吸取測(cè)定管溶液、0.1M谷氨酸溶液、對(duì)照管溶液、0.1M丙氨酸溶液。在點(diǎn)樣處點(diǎn)樣，注意斑點(diǎn)不可太大，直徑要小于0.3cm。而且每點(diǎn)一滴，吹干后方可再點(diǎn)第二滴，每個(gè)樣品可點(diǎn)2～3次。
⑶ 在濾紙圓心處打一小孔(1mm直徑)，另取同類濾紙條(0.5×2.5cm)，下一半剪成須狀，卷成圓筒，如燈芯，從點(diǎn)樣相反的一側(cè)插入小孔。
⑷ 將層析溶劑(水飽和酚溶液)放入直徑為3～5cm的干燥表面皿正中，表面皿置于直徑10cm培養(yǎng)皿正中，將濾紙放平在培養(yǎng)皿上，燈芯浸入溶劑中，將另一同樣大小培養(yǎng)皿反蓋上，溶劑沿?zé)粜旧仙綖V紙，再向四周擴(kuò)展，（層析時(shí)間大約45～60分鐘）。溶劑前緣距濾紙邊緣約1cm時(shí)即可取出，用鉛筆劃出溶劑的邊緣， 烘箱 中干燥之。
⑸ 顯色：將濾紙放在培養(yǎng)皿上，噴0.2%的茚三酮乙醇溶液， 烘箱 中干燥，濾紙上會(huì)呈現(xiàn)紫色弧狀條帶。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
用鉛筆畫(huà)出條帶的邊框，測(cè)出表格中的數(shù)值，計(jì)算R f 值。
測(cè)定參數(shù) | 測(cè)定樣品 | 谷氨酸 | 丙氨酸 | 對(duì)照 |
點(diǎn)樣點(diǎn)到斑紋中心距離 (cm) | ||||
點(diǎn)樣點(diǎn)到溶劑前沿距離 (cm) | ||||
R f 值 |
與已知的標(biāo)準(zhǔn)的 氨基酸 Rf進(jìn)行對(duì)比，指出條帶所對(duì)應(yīng)的 氨基酸 ，并根據(jù)結(jié)果解釋轉(zhuǎn)氨作用。
注意事項(xiàng)
1．層析 濾紙 不可用手觸摸，以免有手印。
2．在 濾紙 上劃線時(shí)只需用鉛筆，不可用其它筆。
3．烘烤時(shí)要注意明火。
4．點(diǎn)樣時(shí)毛細(xì)管不能交叉污染。
思考
1．如果對(duì)照管在沸水中煮的時(shí)間不夠充分，會(huì)在層析結(jié)果中出現(xiàn)什么現(xiàn)象？
2．氨基酸紙上色譜鑒定法操作的關(guān)鍵是什么？
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