還原糖和總糖的測定3,5
一、目的
掌握還原糖和總糖測定的基本原理，學習比色法測定還原糖的操作方法和分光光度計的使用。
二、原理
還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。
利用糖的溶解度不同，可將植物 樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計）。
還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內，還原糖的量與棕紅色物質顏色的深淺成正比關系，利用分光光度計，在540nm 波長下測定光密度值，查對標準曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。
由于多糖水解為單糖時，每斷裂一個糖苷鍵需加入一分子 水，所以在計算多糖含量時應乘以0.9。
三、實驗材料、主要儀器和試劑
1． 實驗材料
小麥面粉；精密pH 試紙。
2． 主要儀器
（1）具塞玻璃刻度試管：20mL×1
（2）大離心管：50mL×2
（3）燒杯：100mL×1
（4）三角瓶：100mL×1
（5）容量瓶：100mL×3
（6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1
（7）恒溫水浴鍋
（8）沸水浴
（9）離心機
（10）扭力天平
（11）分光光度計
3． 試劑
（1）1mg/mL 葡萄糖標準
準確稱取80℃烘至恒重的分析純葡萄糖100mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉移到100mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，混勻，4℃冰箱中保存備用。
（2）3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑
將6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g 結晶酚和5g 亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中備用。
（3）碘-碘化鉀溶液：稱取5g 碘和10g 碘化鉀，溶于100mL 蒸餾水中。
（4）酚酞指示劑：稱取0.1g 酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。
（5）6M HCl 和6M NaOH 各100mL。
四、操作步驟
1． 制作葡萄糖標準曲線
取7 支20mL 具塞刻度試管編號，按表1 分別加入濃度為1mg/mL 的葡萄糖標準液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，配成不同葡萄糖含量的反應液。
將各管搖勻，在沸水浴中準確加熱5min，取出，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至20mL，加塞后顛倒混勻，在分光光度計上進行比色。調波長540nm，用0 號管調零點，測出1~6號管的光密度值。以光密度值為縱坐標，葡萄糖含量（mg）為橫坐標，在坐標紙上繪出標準曲線。
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