層析法（色譜法）
層析法也稱色譜法，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相為固定的（稱為固定相），另一個(gè)相則流過此固定相（稱為流動(dòng)相）并使各組分以不同速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離。
層析法是近代 生物 化學(xué)最常用的分析方法之一，運(yùn)用這種方法可以分離性質(zhì)極為相似，而用一般化學(xué)方法難以分離的各種化合物，如各種氨基酸、核苷酸、糖、蛋白質(zhì)等。
層析法有許多種類，可以根據(jù)所用兩個(gè)相的狀態(tài)和操作方式不同進(jìn)行分類
此外，還有凝膠層析、親和層析和高壓液相層析等方法。在討論幾種常用的層析法之前，先介紹一下柱層析法的一般技術(shù)。
一、柱層析法的一般技術(shù)
1、柱層析柱通常是玻璃的。總的說來，長柱分辨力好，但大量物質(zhì)的處理則用粗的柱比較適宜。
2、層析材料的準(zhǔn)備許多材料都可在層析法中使用。在裝柱前這些材料要用溶劑平衡，另外還需作一些預(yù)處理。例如，凝膠層析材料需要溶脹，吸附劑需要加熱或酸處理來活化，離子交換樹脂需要用酸堿處理來得到需的電離形式。
在用溶劑平衡時(shí)，先使材料沉淀，用傾瀉法除去懸浮的細(xì)顆粒，否則由于細(xì)顆粒的堵塞，溶劑的流速將顯著降低
3、裝柱層析柱的填裝是先關(guān)閉出口，用溶劑灌注至1/3 體積，并使支持板下的“死體積”不存有氣泡，再慢慢地向溶劑中加漿狀物，要小心地沿著玻棒傾注以防止氣泡存留在柱內(nèi)。讓懸浮液沉淀，并放出過多的溶劑，為了避免分層，最好一次裝完，如需分幾次填裝，則在二次填裝前應(yīng)先在已經(jīng)沉淀的表面用玻棒攪拌后再傾注，重復(fù)這個(gè)過程，直至裝到需要的高度。用溶液徹底洗滌層析柱后使液面降到比層析床表面略高一點(diǎn)。最后覆蓋一張圓形濾紙或尼龍布，以免加樣時(shí)擾亂床表面。
4、加樣上柱前，先將樣品溶解在溶劑里或?qū)ο疵撘和肝觯瑯悠啡芤旱臐舛葢?yīng)該盡可能高些，以減少樣品溶液體積，使區(qū)帶狹窄。將樣品仔細(xì)加到層析床的表面，打開旋塞至液面與床面齊，然后連接溶劑池，保持一定高度的液面。
5、洗脫下一步是用適當(dāng)?shù)南疵撘喊迅鹘M分依次從柱上洗脫下來。在取代擴(kuò)展法中，溶劑與層析材料的相互作用比柱上的物質(zhì)與層析材料的相互作用要強(qiáng)，于是與柱結(jié)合的分子被取代。每一個(gè)柱能結(jié)合多少物質(zhì)都有一個(gè)限度（即總柱容量）。在取代擴(kuò)展的情況下，當(dāng)樣品上柱量差不多達(dá)到總柱容量的50%時(shí)，一般尚能完全完分離。但是為了得到更好的分辨力，洗脫法更為可取。
洗脫法是最常用的方法。使用洗脫法，上柱量不超過總柱容量的10%，溶劑與柱相互作用比溶質(zhì)與柱的相互作用弱，溶劑越過結(jié)合的分子，逐漸地將它們從柱上沖洗下來。在沖洗過程中各組分因?yàn)槲搅Σ煌饾u分離。
在一個(gè)組分被洗脫后可以更換洗脫液，這就是所謂的分步洗脫。另外，還有一個(gè)可行的方法是逐漸改充溶劑的性質(zhì)，形成一個(gè)離子強(qiáng)度、pH 或極性的遞增梯度從而使各組分依次被洗脫，這種方法稱梯度洗脫，它的優(yōu)點(diǎn)之一是
能夠減少拖尾現(xiàn)象。
6、部分收集及分析柱的流出液可以用人工的方法收收集到一系列 試管 中或使用部人收集器。這種裝置能使每一管按預(yù)定的時(shí)間或滴數(shù)收集流出液，然后自動(dòng)移位，下一管再繼續(xù)收集。洗脫完畢后可選用各種適宜的方法將已收集的許多部分流出液進(jìn)行定量分析，并畫出洗脫物的量對(duì)流出液體積的洗脫曲線。第一部分的蛋白質(zhì)或核酸的含酸的含量可以讓流出液通過一個(gè)流動(dòng)小室測(cè)定其280nm 或260nm 的光吸收來進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)。
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