層析技術(shù)(Layer-analise technique)
離子交換層析技術(shù)是以離子交換纖維素或以離子交換葡聚糖凝膠為固定相，以蛋白質(zhì)等樣品為移動相，分離和提純蛋白質(zhì)、核酸、酶、激素和多糖等的一項技術(shù)。
（一）原理
在纖維素與葡聚糖分子上結(jié)合有一定的離子基團(tuán)，當(dāng)結(jié)合陽離子基團(tuán)時，可換出陰離子，則稱為陰離子交換劑。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纖維素。
在纖維素上結(jié)合了DEAE，含有帶正電荷的陽離子纖維素―O―C6H14 N+ H，它的反離子為陰離子（如Cl- 等），可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)陰離子進(jìn)行交換。當(dāng)結(jié)合陰離子基團(tuán)時，可置換陽離子，稱為陽離子交換劑，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纖維素。纖維素分子上帶有負(fù)電荷的陰離子（纖維素－O－CH2 －COO－），其反離子為陽離子（如Na+ 等）,可與帶正電荷蛋白質(zhì)陽離子進(jìn)行交換。
溶液的pH值與蛋白質(zhì)等電點相同時，靜電荷為0，當(dāng)溶液pH值大于蛋白質(zhì)等電點時，則羧基游離，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷。
反之，溶液的pH值小于蛋白質(zhì)等電點時，則氨基電離，蛋白質(zhì)帶正電荷。溶液的pH值距蛋白質(zhì)等電點越遠(yuǎn)，蛋白質(zhì)的電荷越多。反之則越少。血清蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷，但各種蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的程度有所差異，以白蛋白為最多，依次為 球蛋白，球蛋白和 球蛋白。
在適當(dāng)?shù)柠}濃度下，溶液的pH值高于等電點時，蛋白質(zhì)被陰離子交換劑所吸附；當(dāng)溶液的pH值低于等電點時，蛋白質(zhì)被陽離子交換劑所吸附。由于各種蛋白質(zhì)所帶的電荷不同。它們與交換劑的結(jié)合程度也不同，只要溶液pH值發(fā)生改變，就會直接影響到蛋白質(zhì)與交換劑的吸附，從而可能把不同的蛋白質(zhì)逐個分離開來。
交換劑對膠體離子（如蛋白質(zhì)）和無機鹽離子（如NaCl）都具有交換吸附的能力，當(dāng)兩者同時存在于一個層析過程中，則產(chǎn)生競爭性的交換吸附。當(dāng)Cl-的濃度大時，蛋白質(zhì)不容易被吸附，吸附后也易于被洗脫，當(dāng)Cl- 濃度小時，蛋白質(zhì)易被吸附，吸附后也不容易被洗脫。
因此，在離子交換層析中，一般采用兩種方法達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。一種是增加洗脫液的離子強度，一種是改變洗脫液的pH值。
pH值增高時，抑制蛋白質(zhì)陽離子化，隨之對陽離子交換劑的吸附力減弱。pH值降低時，抑制蛋白質(zhì)陰離子化，隨之降低了蛋白質(zhì)對陰離子交換劑的吸附。當(dāng)使用陰離子交換劑時，增加鹽離子，則降低pH值。當(dāng)使用陽離子交換劑時，增加鹽離子濃度，則升高溶液pH值。
（二）常用離子交換劑的種類與特性
1.離子交換纖維素 離子交換纖維素的種類很多，其種類與特性如表1－1所示。
表1-1 離子交換劑的類型與特點
交換劑 | 名 稱（纖維素） | 作 用 基 團(tuán) | 特 點 |
陰離子 交換劑 | 二乙氨基乙基 | DEAE+ -O-C2 H4 N+ (C2 H5 )2 H | 最常用在pH8.6以下 |
三乙氨基乙基 | DEAE+ -O-C2 H4 N+ (C2 H5 )2 H | ||
氨乙基 | AE+ -O-C2 H4 -N H2 | ||
胍乙基 | 強堿性、極高pH仍有效 | ||
陽離子 交換劑 | 羧甲基 | CM― -O-CH2 -COO― | 最常用在pH4以上 |
磷酸 | P－ -O- P O2 － | 用于低pH | |
磺甲基 | SM－ -O-CH2 -SO3 － | ||
磺乙基 | SE－ -O-C2 H4 -SO3 － | 強酸性用于極低pH |
在交換纖維素中，最常用的是DEAE―纖維素和CM纖維素。由于劑型不同，其理化性質(zhì)和作用也有所差異。一般而言，微粒型要優(yōu)于纖維素型，因為微粒型是在纖維素型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提煉而成。它的交換容量大，粒細(xì)、比重大，能裝成緊密的層析柱，要求分辨力高的實驗可用此型纖維素（見表1－2）。
表1-2 商品DEAE―纖維素和C M纖維素的類型和特性
纖維素 | 形狀 | 長度 | 交換當(dāng)量 （毫克當(dāng)量/克） | 蛋白質(zhì)吸附容量 （mg /g牛血清白蛋白） | 床體積（ml / g） | |
pH 6.0 | pH 7.6 | |||||
DE-22 | 改良纖維 | 12~400 | 1.0±0.1 | 450 | 7.7 | 7.7 |
DE-23 | 改良纖維 （除細(xì)粒） | 18~400 | 450 | 8.3 | 9.1 | |
DE-32 | 微粒型（干） | 24~63 | 660 | 6.0 | 6.7 | |
DE-52 | 微粒型（濕） | 24~63 | 660 | 6.0 | 6.3 | |
DE-11 | 舊型號 | 50~250 | 130 | |||
與以上相應(yīng) 型號同 | 溶菌酶pH5 | |||||
CM-22 | 0.6±0.06 | 600 | 7.7 | 7.7 | ||
CM-23 | 600 | 9.1 | 9.1 | |||
CM-32 | 1 260 | 6.8 | 6.7 | |||
CM-52 | 1.0±0.1 | 1 260 | 6.8 | 6.7 | ||
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