氨基酸分離與鑒定--雙向?qū)游龇?/strong>
目的要求
(1)學(xué)習(xí)雙向紙層析的原理。
(2)掌握紙層析法分離混合氨基酸的操作方法。
實驗原理
紙層析是以濾紙作支持物,用一定的溶劑系統(tǒng)展開,使混合樣品達(dá)到分離分析的層析方法。其一般操作是將樣品溶解在適當(dāng)溶劑中,點樣在濾紙的一端;再選用適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng),從點樣的一端通過毛細(xì)現(xiàn)象向另一端展開,展開完畢,取出濾紙晾干或烘干,再以適當(dāng)?shù)娘@色劑或紫外燈、熒光燈下觀察其圖譜。樣品經(jīng)展開后某一物質(zhì)在紙層析譜上的位置常用比移值Rf 來表示。
Rf=
紙層析可看作是溶質(zhì)(樣品)在固定相與流動相之間的連續(xù)抽提,由于溶質(zhì)在兩相之間的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離。一定的物質(zhì)在兩相間有固定的分配系數(shù),因而在恒定條件(液劑、PH、溫度)下,各物質(zhì)有固定的Rf 值,據(jù)此可達(dá)到分析鑒定的目的。
由于濾紙纖維可吸收20~25%的水分;且其中6~7%以氫鍵形式與纖維素上羥基結(jié)合,一般條件下難脫去;所以紙層析實際上是以水相作固定相,展開的溶劑作流動相。
紙層析操作按溶劑展開方向可分為上行、下行和徑向三種。氨基酸分離一般用上行法。上行法又分單向(成分較為簡單的樣品)和雙向(單向時斑點重疊分離不開,于是在其垂直方向用另一種溶劑系統(tǒng)展層)。雙相層析譜可分辨十幾種以上的樣品。
層析溶劑要求:
(1)被分離物質(zhì)在該溶劑系統(tǒng)中Rf 在0.05~0.8之間,各組分之Rf 值相差最好能大于0.05,以免斑點重疊。
(2)溶劑系統(tǒng)中任一組分與被分離物之間不能起化學(xué)反應(yīng)。
(3)被分離物質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中的分配較恒定,不隨溫度而變化,且易迅速達(dá)到平衡,這樣所得斑點較圓整。
本實驗采用八種混合氨基酸為樣品,用酸性和堿性兩種溶劑進行雙向?qū)游觯攒崛獮轱@色劑,可獲得分離清晰的層析圖譜,如圖3.2所示。
試劑和器材
一、試劑
0.1%(W/V)茚三酮丙酮液。
溶劑系統(tǒng):第一相:正丁醇∶88%甲酸∶水=15∶3∶2(V/V);
第二相:正丁醇∶吡啶∶95%乙醇∶水=5∶1∶1∶1(V/V)。
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