大鼠皮層神經元原代培養

液體配制：

硼酸硼砂緩沖液：0.05M四硼化鈉45ml，0.2M硼酸55ml，pH8.4；

胰酶－EDTA消化液：胰酶－0.125g；EDTA－0.2g；D-Hanks平衡鹽液定容至100ml

所用的培養板、培養瓶或玻片預先經100μg/L多聚賴氨酸硼酸鹽緩沖液于37℃包被4h，三蒸水洗三遍晾干備用。

操作步驟如下：

1、孕16d SD大鼠經戊巴比妥鈉麻醉后，碘酒、75％乙醇消毒腹部皮膚，依次剪開皮膚、肌肉、皮下筋膜，無菌操作下取出胚胎放入預冷的D-Hanks平衡鹽液中。

2、在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層，除去腦膜，剪碎組織成約1mm3大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱內消化20min，中間搖晃一次。

3、隨后用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的培養液（DMEM＋10％FBS）的離心管內終止消化液作用5min。

4、用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的DMEM＋10％FBS的離心管內，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數次，靜置后取上清吸到另一支離心管內。重復上述步驟2～3次。

5、將所收集的上清經200目篩網過濾。

6、過濾后的細胞懸液于800r/min離心5min，棄上清，管內加入新鮮培養液（DMEM＋20％FBS）并吹打成單細胞懸液。

7、細胞計數，調整細胞密度按1.5×105/cm2種入6孔板內，放入CO2孵箱中培養。培養48h后換液并加入Ara-C使其終濃度為1×10-5mM/L。Ara-C作用24h后全量換液。以后每隔3天半量換液一次。

【注意以下幾點】

1、上面的步驟是傳統方法。有許多地方可以進行改動：如消化時可以直接用0.125－0.25的胰酶消化15－20min左右，也可用DNA酶進行消化，有人還直接進行吹打，都可行。

2、上面雖然時大鼠皮層神經元，但是同樣適用于小鼠，但是應該選擇 孕13d 左右的小鼠。

3、神經元是一種比較難培養的細胞，因此在接種時細胞的密度一定要夠！！

4、在玻片上培養神經元時，一定要注意玻片的來源和處理方法，這個非常重要，對神經細胞的影響是很大的。如果您現在在玻片上培養的神經元生長情況還不錯的話，那么您在以后的培養中最好還是用同一來源（廠家）的玻片。

5、如果有B27和neurobasal培養基，那么就方便了（不用加AraC）－－

（1）把細胞懸液用（DMEM＋20％FBS）懸浮，種到培養皿上6－12h后，全量換成2％B27的neurobasal培養基，繼續培養，3d半量換液。

（2）把細胞懸液用直接用2％B27的neurobasal培養基懸浮接種。

（3）可以用新生1d內的胎鼠皮層直接培養。

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