LAK/TIL細胞的制備

一、LAK細胞的制備

試劑及材料

1. PHA

2. rhIL-2

3. 20%NCS-RPMI-1640培養液

操作方法

1. 常規分離PBM或將正常人外傷摘除的脾臟按常規方法制備成單個脾細胞懸液，用含20%NCS的RPMI-1640完全培養液調整細胞濃度至1×106 /ml；

2. 將上述細胞加入24孔培養板孔中，同時加入60μg PHA，rhIL-2（終濃度為500U/ml），將細胞置37℃，5%CO2 條件下培養，2～3d換液一次。吸棄1/2上清，加入含100U/ml的重組人IL-2 20%NCS-RPMI-1640培養液，繼續培養3d，收集細胞，即為LAK。

二、TIL細胞的分離制備

試劑及材料

IL-2；RPMI-1640；Ⅰ、Ⅳ型膠原酶、DNA酶；0.001%的透明質酸酶和DNA酶；80目和200目不銹鋼網。

操作方法

1. 無菌切取腫瘤組織或腫瘤浸潤的局部淋巴結，置于含抗生素的RPMI-1640培養液中；

2. 將瘤體機械法剪碎，用RPMI-1640調整體積為10～20ml，同時加入0.05%的Ⅰ、Ⅳ型膠原酶、0.001%的透明質酸酶和DNA酶，室溫攪拌4～6h；

3. 依次用80目和200目不銹鋼網過濾；

4. 經過濾后的細胞懸液以無血清的RPMI-1640洗2次，1500rmin離心5～10min；

5. 用含5%NCS的RPMI-1640完全培養液重懸細胞，將5ml比重為1.077的100%淋巴細胞分層液加入試管底層，其上緩慢加入75%的淋巴細胞分層液（用RPMI-1640配制）然后緩慢加入上述腫瘤細胞懸液3～5ml；

6. 經1500～1800r/min離心20min后，分別收集75%和100%淋巴細胞分層液界面層的TIL細胞和其上層的瘤細胞；

7. 用RPMI-1640洗滌2次，每次1500r/min離心5～10min。腫瘤細胞加入凍存液后液氮凍存備用。TIL則用含20%NCS的RPMI-1640調整細胞濃度為0.5×106 /ml；

8. 將上述細胞懸液接種于24孔培養板（1ml/孔），同時分別加入IL-2 1000U/或IL-2和CD3 McAb 1μg/ml，置37℃，5%CO2 溫箱培養3～4周，其間3～5d更換新鮮配制的含IL-2的RPMI-1640完全培養液.

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