微載體培養(yǎng)技術(shù)（microcarrier culture technique）

一、微載體培養(yǎng)應(yīng)用

此技術(shù)于1967年被用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。經(jīng)過三十余年的發(fā)展，該技術(shù)目前已漸日趨完善和成熟，并廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)疫苗、基因工程產(chǎn)品等。

微載體培養(yǎng)是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，放大容易。目前微載體培養(yǎng)廣泛用于培養(yǎng)各種類型細(xì)胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如293細(xì)胞、成肌細(xì)胞、Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞。

使用較多的反應(yīng)器有兩種：貝朗公司的BIOSTAT?B反應(yīng)器，使用雙槳葉無(wú)氣泡通氣攪拌系統(tǒng)；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應(yīng)器，使用Cell-lift雙篩網(wǎng)攪拌系統(tǒng)。兩種系統(tǒng)都能實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞和收獲產(chǎn)物的有效分離。

二、微載體

是指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。

自Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50 研制的第一種微載體問世以來(lái)，國(guó)際市場(chǎng)上出售的微載體商品的類型已經(jīng)達(dá)十幾種以上，包括液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用商品化微載體有三種：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。

微載體的大小：增大單位體積內(nèi)表面積（S/F）對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)非常有利。使微載體直徑盡可能小，最好控制在100-200μm之間。

微載體的密度：一般為1.03-1.05g/cm2，隨著細(xì)胞的貼附及生長(zhǎng)，密度可逐漸增大。

微載體的表面電荷：據(jù)研究，控制細(xì)胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質(zhì)。若電荷密度太低，細(xì)胞貼附不充分，但電荷密度過大，反而會(huì)產(chǎn)生“毒性”效應(yīng)。

三、微載體培養(yǎng)原理與操作

1.原理：其原理是將對(duì)細(xì)胞無(wú)害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。

貼壁依賴性細(xì)胞在微載體表面上的增殖，要經(jīng)歷黏附貼壁、生長(zhǎng)和擴(kuò)展成單層三個(gè)階段。細(xì)胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖，故細(xì)胞在微載體表面的貼附是進(jìn)一步鋪展和生長(zhǎng)的關(guān)鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。

細(xì)胞能否在微載體表面黏附，主要取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和相融性。

2. 攪拌轉(zhuǎn)速：由于動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，對(duì)剪切力敏感，因而無(wú)法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)增加接觸概率。通常的操作方式是：在貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時(shí)攪時(shí)停；數(shù)小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體表面時(shí)，維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進(jìn)入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大速度75r/min。

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