視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)純化及鑒定

1.材料和方法

1.1 DMEM/F12條件培養(yǎng)液（亞硒酸鈉40μg·L-1，腐胺16.2 mg·L-1，轉(zhuǎn)鐵蛋白100 mg·L-1，胰島素234U·L-1，甲狀腺素0.4μg·L-1，黃體酮0.62 mg·L-1，谷氨酰胺3g·L-1）。DMEM/F12培養(yǎng)基、小牛血清購(gòu)自Hyclone公司，兔抗鼠GC抗體、亞硒酸鈉、腐胺等購(gòu)自Sigma公司。

1.2 視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源、培養(yǎng) 取新生2d的Wistar大鼠10只（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物中心提供），無(wú)菌條件下取出雙側(cè)視神經(jīng)。接種至24孔培養(yǎng)板內(nèi)經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片上。

而后加入含30g·L-1小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，37(C，50mL·L-1 CO2，100%濕度連續(xù)培養(yǎng)3d。3d后棄廢液，改為含5g·L-1小牛血清DMEM/F12條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每周換液2次。在獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量后，改用無(wú)血清條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2d換液一次。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察 每天在倒置顯微鏡（日本Olympus），觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程和形態(tài)學(xué)變化并拍照。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定：將含細(xì)胞蓋玻片取出，0.01mol·L-1 PBS沖洗3次×5min；冷丙酮固定10 min；PBS沖洗（3次×5min）；30g·L-1過(guò)氧化氫室溫孵育15min；PBS沖洗3次×5min；

滴加正常山羊血清，室溫孵育20 min；滴加1:100 GC抗體，陰性對(duì)照以PBS代替一抗，37(C孵育60min；PBS沖洗3次×5min；滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，37(C，20min；PBS沖洗3次×5min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液；DAB工作液（武漢博士德公司）顯色，自來(lái)水終止反應(yīng)；脫水，透明，D·P·X封片保存。

2.結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

組織塊24ｈ開(kāi)始貼壁，48～72ｈ可見(jiàn)神經(jīng)組織邊緣游出少量細(xì)胞，主要為圓形或梭形。8～9d左右，細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)孔。此時(shí)改用無(wú)血清條件培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行純化。培養(yǎng)過(guò)程中，部分細(xì)胞死亡。12d左右獲得的細(xì)胞胞體基本為呈圓形或多角型，直徑約6～10μm。細(xì)胞核較大，胞質(zhì)少。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

培養(yǎng)的視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色GC蛋白陽(yáng)性，未加一抗的呈陰性。染色結(jié)果顯示成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞突起豐富，互相形成蜘蛛網(wǎng)狀。蘇木素復(fù)染，異質(zhì)細(xì)胞較少，90%以上為陽(yáng)性細(xì)胞。

3.討論

抑制神經(jīng)再生基因Nogo的發(fā)現(xiàn)為視神經(jīng)損傷的修復(fù)、視功能保護(hù)研究帶來(lái)了希望。視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞2種類型,分化不同,功能各異。成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞不再具有分裂增殖能力，為分裂終期細(xì)胞，培養(yǎng)較為困難。

1980年McCarthy等建立了從腦灰質(zhì)組織分離、純化星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)模型。

目前國(guó)內(nèi)外多采用該法。利用少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞貼壁能力的不同采用振動(dòng)分離法進(jìn)行分離、培養(yǎng)。此法主要用來(lái)獲取星形膠質(zhì)細(xì)胞，獲得的少突膠質(zhì)細(xì)胞較少。存在著操作步驟多容易被污染、分離過(guò)程中因振蕩離心易造成機(jī)械性損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡等缺點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)采用視神經(jīng)組織塊培養(yǎng)的方法，對(duì)新生大鼠的視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行條件化原代培養(yǎng)，利用少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)條件的不同，采用條件培養(yǎng)基純化2種細(xì)胞。

少突膠質(zhì)細(xì)胞和Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞是從一種普通雙潛能的少突膠質(zhì)細(xì)胞－2型星形膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞（oligodendrocyte-type-2astrocyte progenitor cell，O2A）發(fā)育而來(lái)。大鼠出生后約1周，少突膠質(zhì)細(xì)胞逐漸成熟。

因此，從新生大鼠取材可獲得O2A祖細(xì)胞。體外研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺素、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、腐胺、黃體酮和微量元素硒等，可使O2A祖細(xì)胞朝少突膠質(zhì)細(xì)胞定向分化。而血清等可以誘導(dǎo)O2A祖細(xì)胞分化為Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞。

我們利用這一特點(diǎn)，逐步減少條件培養(yǎng)基中的血清濃度，促進(jìn)O2A祖細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。最終采用無(wú)血清條件培養(yǎng)基，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞及其它異質(zhì)細(xì)胞增殖，而少突膠質(zhì)細(xì)胞在此條件下則基本不受影響。

GC是表達(dá)于少突膠質(zhì)細(xì)胞膜以及髓鞘的一種主要類脂，它是識(shí)別少突膠質(zhì)細(xì)胞普遍應(yīng)用的特異性化學(xué)標(biāo)志物。免疫染色鑒定結(jié)果表明純度較高超過(guò)90％。此方法簡(jiǎn)便、可靠、易于推廣，便于對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)課題進(jìn)行研究。

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