肺泡2型細胞的分離培養

1、稱體重

2、腹腔內注射苯巴比妥鈉50ｍｇ/kg將大鼠處死,用酒精嚴格消毒大鼠下頜至全腹皮膚及鼠毛,剪開下頜至中腹部皮膚,打開腹腔,推開肝臟并分離出肝及膈肌間的下腔靜脈并給予切開放血。

3、肺血管灌洗：分離并部分橫斷切開氣管,插入連接有10ｍｌ注射器(內裝ｐＨ7.0ＰＢＳ)的灌洗管并用細線加以固定,在固定的離心段剪斷氣管,剪開肋骨并打開胸腔將肺和心臟提出胸腔。

用20號針(另一端連接20ｍｌ的注射器)穿刺進入右心室并順著右心室插入到肺動脈進行肺血管的灌洗。直至左心房流出清亮液體，將肺和心臟、氣管一起取下，灌洗成功的肺呈蒼白色。

4、肺印片：革蘭氏染色、改良GMS染色,

5、支氣管灌洗：通過注射器行支氣管肺泡灌洗,每次灌洗10ｍｌ,連續7～8次,回收40～50ｍｌ支氣管肺泡灌洗液。將BALFs離心30min(2000r/m),棄上清再混勻沉淀物，加入DMEM移入培養瓶中培養。

6、取不同斷面的肺組織，甲醛固定，留作切片。

7、胰酶消化：經氣管注入胰酶15ml，37度水浴，消化20分鐘，間隔10min補加胰酶10ml.。將肺在2ml DNase中剪碎，，搖床重震蕩5-10分鐘， 100目————200目過濾，用顯微鏡觀察消化情況，加5ml 血清中止消化，4度，1000r/ml離心10分鐘，3mlDMEM懸浮細胞。Percoll梯度離心，DMEM洗，培養。

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