原代培養結腸平滑肌細胞

實驗步驟

（一）、取SD 大鼠一只，實驗時斷椎處死。

（二）、在無菌條件下快速自肛門上2 cm 取結腸10 cm 左右，生理鹽水中反復灌腸沖洗。

（三）、移入含300 U/ml青霉素、300 U/ml 鏈霉素的HepesRinger緩沖液中浸泡，腸段內外各15 min。

（四）、將經抗生素浸泡過的腸段移入含Hepes Ringer緩沖液的塑料培養板中（培養板預先鋪上705膠），在體視顯微鏡下沿腸系膜對側縱行切開腸段，皮內針固定好四角，仔細地刮除粘膜層，翻轉至外側，小心地撕去腸系膜，再仔細地刮去漿膜層。

（五）、反復用鑷子側角刮腸段的內、外層，直至余下的組織層在體視顯微鏡下觀察到呈透明的一層為止。將組織層剪碎勻漿，加入到4 ml 含0.1% Ⅱ 膠元酶和0.01% 大豆胰蛋白酶抑制劑的消化液中，30 ℃ 恒溫水浴震蕩20 min，離心，棄消化液。

（六）、再加入6 ml消化液，30 ℃ 恒溫水浴震蕩30 min，加對倍緩沖液中止消化，用滴管反復輕柔吹打。

（七）、1000 r/min離心5 min，用10 ml DMEM 培養液重懸細胞。

（八）、過100目細胞篩網，取細胞濾液用Trypan 藍染色檢查細胞活性，確認活細胞在90% 以上。

（九）、用DMEM 培養液將細胞濃度調整至5×104/ml，接種至培養瓶中，放入培養箱內，37℃ 95% O2 和5%CO2條件下培養。

（十）、細胞培養24 h 后換液，棄去未貼壁細胞，加入培養液繼續培養，以后每3～4 天換液1次，期間用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。細胞培養14 d 后，細胞可長成致密單層，即可傳代培養。

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