膀胱平滑肌細胞原代培養(yǎng)

1、麻醉后消毒，下腹正中切口于膀胱頸（結扎處遠端約1~2cm），嚴格無菌操作取出標本、手術臺位于超凈臺旁

2、在超凈臺，40u/ml慶大霉素溶液中浸泡5分鐘

3、生理鹽水漂洗1次

4、D－h(huán)anks液漂洗1次

5、放入D－h(huán)anks液中，除去粘膜、粘膜下及漿膜

如果是Shame組兔，以10ml注射器抽取約8ml D－h(huán)anks液，于粘膜層下注射起泡后，剪去粘膜層，直接剪取平滑肌組織，棄漿膜層及其上未剪下之肌組織。

new: 如果是不全BOO兔，則可將膀胱剪成寬約0.5cm之條狀，撕去粘膜層后，助手以一眼科鑷將該組織一端固定，眼科鑷與該組織垂直，并夾持整個橫截面，術者同法夾持于附近，助手持第3把眼科鑷提起肌組織，術者以手術刀銳性分離肌層；如此，向另一端推進，銳性分離肌條。

6、在超凈臺，取相當于0.5為X0.5 CM2肌塊，室溫下將其剪碎成1~2mm碎組織塊

7、轉移入離心管

8、加入D－h(huán)anks液(操作成功)　OR　Dulbecco

9、離心1000轉/min，10分鐘 離心半徑13cm?棄上清

10、加入I型膠原酶（2mg/ml） 5mg,(II型膠原酶2mg/ml 5mg也可，但效果不如I型膠原酶)

11、不要加入DMEM為主要成分的培養(yǎng)液(否則胰蛋白酶失活)

12、轉移入培養(yǎng)瓶中

13、4度下過夜孵育。

14、加0.25%胰蛋白酶,36.5度振蕩消化15~30min,棄上清。

15、200目(74um)不銹鋼網(wǎng)過濾。(可省)，轉移入離心管,***吹打后待可見物沉淀，吸盡沉淀（避免組織塊培養(yǎng)法）

16、離心1000轉/min，10分鐘 離心半徑13cm?棄上清

18、加培養(yǎng)液至10ml(ok)

17、轉移入培養(yǎng)瓶中

19、CO2恒溫箱中培養(yǎng)

20、12h后收集未貼壁細胞并計數(shù)

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