正常動物腸肥大細(xì)胞的培養(yǎng)

實驗材料：

1. 正常動物的腸或者手術(shù)切除標(biāo)本的正常腸組織；

2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3. TE液：Tyrode液加入2 mmol/L EDTA。Tyrode液含137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、0.36 mmol/L NaH2 PO4 、5.55 mmol/L 葡萄糖；

4. TEA液：TE液加入200mg/L氨芐青霉素、200mg/L慶大霉素和40mg/L甲硝唑；

5. TGMD液：Tyrode液加入0.1%明膠、1.23 mmol/L MgCl2 和15mg/L DNA酶；

6. HA液：HEPES液補(bǔ)充0.25g/L不含脂肪酸的BSA。HEPES液含20 mmol/L HEPES、125 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和0.5 mmol/L 葡萄糖；

7. HACM液HA液補(bǔ)充1 mmol/L CaCl2 和1 mmol/L MgCl2 ；

8. 消化液a：用TE液配成，含有3g/L鏈霉蛋白酶和0.75g/L木瓜凝乳蛋白酶；

9. 消化液b：用TGMD液配成，含有1.5g/L膠原酶和0.15g/L彈性蛋白酶；

10. 1g/L 乙酰半胱氨酸溶液，用TE液配成；

11. Percoll溶液：不含酚紅的RPMI1640，添加10%FBS、50μg/L SCF、25 mmol/L HEPES、100000 IU/L青霉素和100mg/L鏈霉素。pH7.2；

12. 手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、眼科剪，眼科鑷，止血鉗，無菌消毒手術(shù)器械；

13. 離心管（15ml、50ml）

14. 網(wǎng)篩：300μm不銹鋼網(wǎng)篩

實驗方法：

1. 取正常動物腸組織10—40g，用4℃的TEA液中，用眼科剪分離粘膜下層與肌層。將粘膜層和粘膜層切成1cm2 的小塊，放入乙酰半胱氨酸溶液中，室溫下浸泡10min，除去粘液。將組織塊放入含5mmol/L EDTA的TEA液中，然后在培養(yǎng)箱內(nèi)放置15min，除去上皮細(xì)胞；

2. 用TE液充分沖洗組織塊，然后將組織塊剪碎，放入消化液a中，室溫下消化30min。用孔徑為300μm不銹鋼篩網(wǎng)濾去已脫落下來的細(xì)胞。用TE液清洗，然后用消化液a將組織塊重復(fù)消化1次；

3. 將組織塊用TGMD液清洗后，放入消化液b中，在30℃條件下消化30min。用孔徑為300μm不銹鋼篩網(wǎng)濾出組織塊，收集濾液，在4℃條件下離心（400g，10min）。吸去上清液，用HA液混懸沉淀細(xì)胞，在4℃條件下保存；

4. 按操作步驟3重新操作1次，得到細(xì)胞懸液；

5. 將操作步驟3和4收集的細(xì)胞懸液混合，用孔徑為100μm不銹鋼篩網(wǎng)過濾，收集濾液，在4℃條件下離心（400g，10min）。用HACM液混懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至0.5×106 —2×106 個/ml；

6. 在50ml離心管中加入濃度為1.037g/ml的Percoll溶液20ml，將細(xì)胞懸液加于Percoll溶液表面上，然后在20℃條件下離心（400g，10min）。用HA液混懸沉淀細(xì)胞，在4℃條件下離心（400g，10min），然后重復(fù)離心1次；

7. 用培養(yǎng)液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至0.5×106 —2×106 個/ml，放37℃、5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換液，以后每周換液1次。

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