ELISA實驗中血清標(biāo)本的采集、保存及注意事項

• 細(xì)胞培養(yǎng)基的配制 細(xì)胞培養(yǎng)專題 ELISA免疫實驗技術(shù)

大部分ELISA 檢測均以血清為標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP 為標(biāo)記的ELISA 測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細(xì)菌 污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。一般說來，在5 天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃，標(biāo)本在冰箱中保存時間過長導(dǎo)致血清IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需-20℃保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡。混濁或有沉淀的血清標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防腐劑。

抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑。

具體注意事項：

1) 要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標(biāo)記酶的ELISA測定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。

2) 樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細(xì)菌污染，一則細(xì)菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原 抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用;二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌 的β-半乳糖苷酶本身會對用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。

3) 血清標(biāo)本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應(yīng)在-70℃以下。

4) 冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機械剪切力將對標(biāo)本中的蛋白等分子 產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。此外，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)注意，不要進行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可。

5) 標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測。