凝膠層析的概念及其原理
凝膠層析定義
凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等。
它的突出優(yōu)點(diǎn)是層析所用的凝膠屬于惰性載體 ，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，并且對(duì)分離成分理化性質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。
對(duì)于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。
凝膠層析是按照蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，又稱之凝膠過濾，分子篩層析或排阻層析。
凝膠層析原理
單個(gè)凝膠珠本身象個(gè)"篩子"。
不同類型凝膠的篩孔的大小不同。
如果將這樣的凝膠裝入一個(gè)足夠長(zhǎng)的柱子中，作成一個(gè)凝膠柱。
當(dāng)含有大小不同的蛋白質(zhì)樣品加到凝膠柱上時(shí)，比凝膠珠平均孔徑小的蛋白質(zhì)就要連續(xù)不斷地穿入珠子的內(nèi)部，這樣的小分子 不但其運(yùn)動(dòng)路程長(zhǎng)，而且受到來自凝膠珠內(nèi)部的阻力也很大，所以越小的蛋白質(zhì)，把它們從柱子上洗脫下來所花費(fèi)的時(shí)間越長(zhǎng)!凝膠中只有很少的孔徑可接受大的蛋白。
因此，大的蛋白質(zhì)直接通過凝膠珠之間的縫隙首先被洗脫下來。凝膠過濾所用的凝膠孔徑大小的選擇主要取決于要純化的蛋白質(zhì)分子量。
凝膠層析分類
葡聚糖凝膠是指由天然高分子 -葡聚糖與其它交聯(lián)劑交聯(lián)而成的凝膠。
葡聚糖凝膠主要由Pharmacia Biotech 生產(chǎn)。
常見的有兩大類，商品名分別為Sephadex 和Sephacryl。
葡聚糖凝膠中最常見的是Sephadex 系列，它是葡聚糖與3-氯-1，2環(huán)氧丙烷(交聯(lián)劑)相互交聯(lián)而成，交聯(lián)度由2環(huán)氧丙烷的百分比控制。Sephadex 的主要型號(hào)是G-10 ~ G-200，后面的數(shù)字是凝膠的吸水率(單位是mL / g 干膠)乘以10。
如Sephadex G-50，表示吸水率是5mL/g 干膠。
Sephadex 的親水性很好，在水中極易膨脹，不同型號(hào)的Sephadex 的吸水率不同，它們的孔穴大小和分離范圍也不同。
數(shù)字越大的，排阻極限越大，分離范圍也越大。
Sephadex 中排阻極限最大的G-200為8×10。
Sephadex 在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液以及有機(jī)溶液中都是比較穩(wěn)定的，可以多次重復(fù)使用。
Sephadex 穩(wěn)定工作的pH 一般為為2~10。
強(qiáng)酸溶液和氧化劑會(huì)使交聯(lián)的糖苷鍵水解斷裂，所以要避免Sephadex 與強(qiáng)酸和氧化劑接觸。
Sephadex 在高溫下穩(wěn)定，可以煮沸消毒，在100 °C 下40 min 對(duì)凝膠的結(jié)構(gòu)和性能都沒有明顯的影響。
Sephadex 由于含有羥基基團(tuán)，故呈弱酸性，這使得它有可能與分離物中的一些帶電基團(tuán)(尤其是堿性蛋白)發(fā)生吸附作用。
但一般在離子強(qiáng)度大于0.05的條件下，幾乎沒有吸附作用。
所以在用Sephadex 進(jìn)行凝膠層析實(shí)驗(yàn)時(shí)常使用一定濃度的鹽溶液作為洗脫液，這樣就可以避免Sephadex 與蛋白發(fā)生吸附，但應(yīng)注意如果鹽濃度過高，會(huì)引起凝膠柱床體積發(fā)生較大的變化。
Sephadex 有各種顆粒大小(一般有粗、中、細(xì)、超細(xì))可以選擇，一般粗顆粒流速快，但分辨率較差;細(xì)顆粒流速慢，但分辨率高。
要根據(jù)分離要求來選擇顆粒大小。
Sephadex 的機(jī)械穩(wěn)定性相對(duì)較差，它不耐壓，分辨率高的細(xì)顆粒要求流速較慢，所以不能實(shí)現(xiàn)快速而高效的分離。
另外，Sephadex G-25和G-50中分別加入羥丙基基團(tuán)反應(yīng)，形成LH 型烷基化葡聚糖凝膠，主要型號(hào)為Sephadex LH-20和LH-60，適用于以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，分離脂溶性物質(zhì)，例如膽固醇、脂肪酸激素等。
Sephacryl 是葡聚糖與甲叉雙丙烯酰胺(N，N'-methylenebisacrylamide)交聯(lián)而成。
是一種比較新型的葡聚糖凝膠。
Sephacryl 的優(yōu)點(diǎn)就是它的分離范圍很大，排阻極限甚至可以達(dá)到108，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Sephadex 的范圍。
所以它不僅可以用于分離一般蛋白，也可以用于分離蛋白多糖、質(zhì)粒 、甚至較大的病毒顆粒。
Sephacryl 與Sephadex 相比另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是它的化學(xué)和機(jī)械穩(wěn)定性更高：Sephacryl 在各種溶劑中很少發(fā)生溶解或降解，可以用各種去污劑、胍、脲等作為洗脫液，耐高溫，Sephacryl 穩(wěn)定工作的pH 一般為3~11。
另外Sephacryl 的機(jī)械性能較好，可以以較高的流速洗脫，比較耐壓，分辨率也較高，所以Sephacryl 相比Sephadex 可以實(shí)現(xiàn)相對(duì)比較快速而且較高分辨率的分離。
凝膠的選擇
凝膠
根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌x擇不同型號(hào)的凝膠。
如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分械拇蠓肿游镔|(zhì)和小分子 物質(zhì)分開，由于它們?cè)诜峙湎禂?shù)上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用Sephadex G-25和G-50，對(duì)于小肽和低分子量的物質(zhì)(1000-5000)的脫鹽可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。
如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍悠分幸恍┓肿恿勘容^近似的物質(zhì)進(jìn)行分離，這種分離又叫分級(jí)分離。
一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠，層析過程中這些物質(zhì)都能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，由于Kd不同，最后得到分離。
根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，組別分離時(shí)，大多采用2-30cm長(zhǎng)的層析柱，分級(jí)分離時(shí)，一般需要100cm左右長(zhǎng)的層析柱，其直徑在1-5cm范圍內(nèi)，小于1cm產(chǎn)生管壁效應(yīng)，大于5cm則稀釋現(xiàn)象嚴(yán)重。
長(zhǎng)度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對(duì)移動(dòng)慢的物質(zhì)宜在30-40之間。
凝膠柱的制備
凝膠型號(hào)選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細(xì)的小顆粒傾瀉出去。
自然溶脹費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時(shí)即可達(dá)到凝膠的充分脹溶。
加熱法既可節(jié)省時(shí)間又可消毒。
凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個(gè)帶有攪拌裝置的較大容器，柱內(nèi)充滿洗脫液，將凝膠調(diào)成較稀薄的漿頭液盛于柱頂?shù)娜萜髦校缓笤谖⑽⒌財(cái)嚢柘率鼓z下沉于柱內(nèi)，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應(yīng)的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。
稍放置一段時(shí)間，再開始流動(dòng)平衡，流速應(yīng)低于層析時(shí)所需的流速。
在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千萬不能超過最終流速。
平衡凝膠床過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無“紋路”或氣泡，或加一些有色物質(zhì)來觀察色帶的移動(dòng)，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現(xiàn)歪曲、散亂、變寬時(shí)必須重新裝柱。
加樣和洗脫
凝膠床經(jīng)過平衡后，在床頂部留下數(shù)亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。
一般樣品體積不大于凝膠總床體積的5%-10%。樣品濃度與分配系數(shù)無關(guān)，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質(zhì)，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運(yùn)動(dòng)受限，故樣品與洗脫液的相對(duì)粘度不得超過1.5-2。
樣品加入后打開流出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面相平時(shí)，再加入數(shù)毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進(jìn)入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預(yù)先設(shè)計(jì)好流速，然后分部收集洗脫液，并對(duì)每一餾份做定性、定量測(cè)定。
凝膠柱的重復(fù)使用、凝膠回收與保存
一次裝柱后可以反復(fù)使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。
為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02%的疊氮鈉，在下次層析前應(yīng)將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測(cè)定。
如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用70%、90%、95%乙醇脫水平衡至乙醇濃度達(dá)90%以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、干燥保存。
濕態(tài)保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。
凝膠層析的應(yīng)用
⑴ 脫鹽：高分子(如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等)溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。
本法脫鹽操作簡(jiǎn)便、快速、蛋白質(zhì)和酶類等在脫鹽過程中不易變性。
適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。
柱長(zhǎng)與直徑之比為5-15，樣品體積可達(dá)柱床體積的25%-30%，為了防止蛋白質(zhì)脫鹽后溶解度降低會(huì)形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡，然后加入樣品，再用同樣緩沖液洗脫，收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類。
⑵ 用于分離提純：凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質(zhì)的分離提純。
凝膠對(duì)熱原有較強(qiáng)的吸附力，可用來去除無離子水中的致熱原制備注射用水。
⑶ 測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量：用一系列已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)品放入同一凝膠柱內(nèi)，在同一條件下層析，記錄每一分鐘成分的洗脫體積，并以洗脫體積對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，在一定分子量范圍內(nèi)可得一直線，即分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測(cè)定未知物質(zhì)的分子量時(shí)，可將此樣品加在測(cè)定了標(biāo)準(zhǔn)曲線的凝膠柱內(nèi)洗脫后，根據(jù)物質(zhì)的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的分子量。
⑷ 高分子溶液的濃縮：通常將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中，這時(shí)水分和低分子量的物質(zhì)就會(huì)進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部的孔隙中，而高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外，再經(jīng)離心或過濾，將溶脹的凝膠分離出去，就得到了濃縮的高分子溶液
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