薄層色譜的基本原理及流動相/固定相選擇
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薄層色譜，與其他色譜技術的原理一樣，是一種利用樣品中各組成成分的不同物理特性把它們分離開來的技術。
這些物理特性包括分子 的大小、形狀、所帶電荷、揮發性、溶解性及吸附性等。
薄層色譜分離一般是由幾種分離機理綜合的結果，最多的是吸附和分配，也有離子交換或凝膠滲透。
鑒于在薄層色譜的過程中，固定相和流動相的特性因分離原理的不同而差別較大，
因此，為了方便敘述，現分別將各類型的色譜基本原理以及相關固定相和流動相的技術要求簡要介紹如下。
第一節 吸附色譜
一、吸附色譜的原理
吸附色譜法溶解于一相中的混合物的單一組分在另一相界面上會呈現出濃度變化，另一相表面常常出現組分的濃縮，這種現象稱之為吸附。
吸附性薄層色譜法是將吸附劑在光潔的表面，如玻璃、金屬或塑料等表面上均勻地鋪成薄層，而后在上面點上樣品，以流動相展開，這樣，組分不斷地被吸附劑吸附，又被流動相溶解，解吸而向前移動。
由于吸附劑對不同組分有不同的吸附能力，流動相也有不同的解吸能力，與吸附劑結合較緊密的組分較難被展開劑解吸，而與吸附劑結合較松散的組分則較容易被展開劑解吸。
因此在流動相向前流動的過程中，不同組分移動距離不同，原有的混合物就可以得到分離。
分離度一般用比移值Rf值來表示，其數值可以通過被分離組分斑點中心離原點的距離與展開劑前沿離原點的距離之比計算出來。
二、吸附色譜中對固定相的要求
吸附色譜的固定相常稱為吸附劑。
目前最常用的吸附劑是硅膠和氧化鋁，其次是聚酰胺、硅酸鎂等，還有一些物質如氧化鈣(鎂)、氫氧化鈣(鎂)、硫酸鈣(鎂)、磷酸鈣(鎂)、淀粉、蔗糖等，但因堿性太大或吸附性太弱，致使用途有限;而活性炭的吸附性太強，本身又是黑色，故很少用于色譜分離。具體要求如下：
①具有大的表面積和足夠的吸附能力;
②對不同的組分有不同的吸附性，因而能較好地分離不同的化學成分;
③在所用的溶劑和展開劑中不溶解;
④不破壞或分解供試品中各組分，不與供試品中溶劑和展開劑起化學反應;
⑤顆粒大小均勻，一般要求直徑小于70u.m(小于250目)且在使用過程中不會碎裂;
⑥具有可逆的吸附性，既能吸附樣品組分，又易于解吸附;
⑦為便于觀察分離結果，最好是白色固體。
三、吸附色譜中對流動相的要求
流動相的選擇必須根據被分離物質與所選用的吸附劑性質這兩者結合起來加以考慮。
在用極性吸附劑進行色譜分離時，當被分離物質為弱極性物質時，一般選用弱極性溶劑為展開劑;被分離物質為強極性成分時，則需選用極性溶劑為流動相。
如果對某一極性物質使用吸附性較弱的吸附劑(如以硅藻土或滑石粉代替硅膠)，則流動相的極性亦必須相應降低。
在薄層色譜中，當吸附劑活度為一定值時(如Ⅱ級或Ⅲ級)，對多組分的樣品能否獲得滿意的分離，決定于展開劑的選擇。
而展開劑的選擇原則主要還是根據被分離物質的極性選擇相應極性的展開劑。
第二節 分配色譜
一、分配色譜的基本原理
分配色譜法是利用混合物的各個組分在兩相溶劑中的分配系數不同而達到分離的一種色譜方法。
但需將兩相溶劑中的一相，設法固定在某一固體物質上。
這樣的固體物質，如硅藻土、纖維素粉等，常稱為載體。
被載體吸收的溶劑，稱為固定相。
第二相緩慢地在固定相表面上流動，故被稱為流動相。然而，這兩相必須是平衡以后相互飽和，否則將會在色譜分離過程中出現所用溶劑系統的濃度變化。
在色譜過程中，當展開劑流經原點時，被測混合物中的不同物質即在兩相之間進行分配，每展開一點距離，被分離物質都接連不斷地重復地進行著分配。
溶質在固定相中的物質的量濃度與其在流動相中的物質的量濃度之比常稱為分配系數，分配系數小的物質，即在流動相中溶解得多的物質，隨流動相移動的距離就較大，Rf值大;反之，分配系數大的物質，移動的距離較小，Rf值小。
所以經過一定距離展開后，分配系數不同的物質逐漸拉開距離，進而達到分離的目的。一般常用于極性大的成分，如糖、氨基酸、羧酸類、酚類等。
在分配色譜法中的兩相系統內，如一相含有機溶劑較多，而另一相含水較多。
水相通常固定在固體親水性載體上，例如硅膠、硅藻土、淀粉、親水性凝膠、粉狀纖維索、濾紙等。
有機相通常是流動相，這種方法稱為正向色譜法。
如果以疏水性材料的載體用有機相浸漬飽和，而水相是流動相的話，那么這種方法就稱之為反向色譜法。
在一些特殊的情況下，用這種方法可以獲得更好的分離效果。
二、分配色譜中對固定相的要求
分配色譜的固定相常被稱為載體，最常用的載體有纖維素和硅藻土等。
作為分配色譜的載體需要具備以下條件：
①應為中性多孔粉末，對樣品組分無吸附性或吸附性極弱。在色譜過程中不溶于展開劑系統中，與展開劑和樣品組分不起化學反應。
②能吸住一定量的固定相，對固定液是惰性的，并不改變其組成，而流動相又能自由通過。
③表面積大，吸住的固定相應盡量多，最好能達到載體重量的50%以上。如硅藻土作為分配色譜的載體效果很好，因為硅藻土可吸收其重量的100%的水，而幾乎無吸附性能，它們主要應用于分離蛋白質、核酸、酶、糖等物質，在生化方面應用較多。
三、分配色譜中對流動相的要求
構成分配色譜的溶劑系統種類繁多，一般針對被分離化合物的性質進行選擇，大多數是采用復合的溶劑系統，可通過調節溶劑系統的性質，使之與被分離的化合物性質相適應。
例如，一個強極性溶劑A與一個弱極性溶劑B混合，通過改變其組成比例，可得到一系列中極性強度的流動相系統。
表2—1就是根據被分離化合物的性質得到固定相與流動相之間的關系。
第三節 離子交換色譜
一、離子交換色譜的基本原理
離子交換色譜適用于氨基酸、蛋白質、蛋白質水解物以及其他離子型化合物。
以離子交換樹脂作為固定相，用水或與水混合的溶劑作為流動相。
在流動相中存在的離子性物質與樹脂進行離子交換反應而被吸附，代替了因吸附表面活性所產生的吸附作用。
離子交換色譜的分離原理主要表現在以下3個方面：
①利用樣品組分的選擇性系數不同而進行分離;
②利用各組分解離度的差別而進行分離;
③形成絡離子后進行離子交換分離。
當樹脂的種類、性質和實驗條件保持一定以及流動相的各離子強度保持一定時，被分離組分離子在固定相(樹脂)和流動相(溶液)之間的濃度之比是一個常數，此常數稱為分配系數。
分配系數值的大小決定組分離子在樹脂上的保留時間，分配系數值大，則溶質的保留時間長。
二、離子交換色譜中對固定相的要求
離子交換樹脂分為兩大類，即陽離子交換樹脂與陰離子交換樹脂。
離子交換樹脂的樹脂核是由苯乙烯通過二乙烯基苯鏈聚合而成。
二乙烯基苯在離子交換樹脂中所占的重量百分比稱為“交聯度”。
交聯度可反映樹脂的網眼大小。
交聯度越大，樹脂內的孔洞就越小，大分子物質就不易進入樹脂顆粒之內。
例如分離氨基酸或小分子 肽(二肽或三肽)，以8%交聯度的樹脂為宜;而對分子量較大的肽，則以選用2%～4%交聯度較小的樹脂為適宜。一般只要不影響分離的完成，以采用交聯度較高的樹脂比較適宜。
因為交聯度高，網眼小，組成緊密，性質較穩定，不易破壞，壽命長。
但由于網眼小，分子小的離子可進去，分子大的離子進不去，也就是交換不上，因此表現為交換容量小，而選擇性強。
一般情況下，將離子交換樹脂按交聯度的大小分為三級，根據不同需要選擇應用。
如制造離子交換水以選用高交聯度樹脂較好，分離大分子物質則需應用低交聯度的樹脂
三、離子交換色譜中對流動相的要求
離子交換色譜展開劑的選擇要依據被分離化合物的酸堿性，可用各種類型的緩沖液或鹽溶液作為展開劑。
選擇展開劑的前提是根據被分離化合物是酸還是堿，是陰離子還是陽離子來選擇。
為了使這些離子型化合物得到較好的分離，點樣前必須用水或0.1mol/L氯化鈉溶液對薄層板展開一次，即可使離子交換薄層得到再生或活化。
由于水是優良的溶劑并具有電離性，因此大多數用離子交換樹脂進行色譜分離時，都是在水溶液中進行的。
有時亦采用水/甲醇混合溶劑，因為在水相展開劑中加入少量能與水混溶的有機溶劑可以增加樣品組分的溶解度并且改變溶劑的分離選擇性，還可以減少某些組分的拖尾現象。
緩沖液用來控制展開劑的pH值，如在陽離子交換樹脂中，經常采用醋酸、枸櫞酸、磷酸緩沖液 ;在陰離子交換樹脂中，則采用氨水、吡啶等緩沖液。另外也可通過加入某些鹽類溶液來調節展開劑的離子濃度。
常用的離子交換色譜展開劑有四種類型：
①pH=3.0～8.0的各種離子強度的緩沖溶液，如pH8.0的0.005mol/L磷酸緩沖液或pH3.4的2mol/L氯化鉀或氯化鈉溶液;
②鹽溶液，如0.1～2.0mol/L氯化鉀或氯化鈉溶液;
③蒸餾水;
④在上述各種展開劑中加入少量有機溶劑如甲醇、四氫呋喃、乙腈等。
第四節 凝膠色譜
一、凝膠色譜的基本原理
以凝膠為固定相的色譜，稱為凝膠色譜。
葡聚糖凝膠的分離原理是葡聚糖凝膠在吸水后形成凝膠粒子，在其交聯鍵的骨架中有許多一定大小的網眼。
網眼大，大分子物質能進入網眼內;網眼小，只有小分子物質才能進入網眼;而超過一定限度的大分子物質，就被排阻在凝膠粒子的外部而不能進入網眼。
這就使得能進入凝膠內部與不能進入凝膠內部的分子，如同按照分子大小過篩一樣，所以稱為分子篩。
操作時首先將凝膠在適宜的溶劑中浸泡，使其充分膨脹，然后再鋪成薄層，加入樣品后，再以同一溶劑洗脫，則樣品中大分子化合物不能進入凝膠顆粒內部，只在凝膠顆粒間移動，因此阻力小，行動快，走在前面;而小分子化合物能自由擴散進入到凝膠內部，因此在色譜時受到的阻力較大，行動慢，走在后面。如此經過一段時間的洗脫，混合物中各組分就會按照分子的大小而獲得分離。
二、凝膠色譜中對固定相的要求
凝膠色譜常用的凝膠是葡聚糖凝膠。葡聚糖凝膠常被分為親水性葡聚糖凝膠、親脂性葡聚糖凝膠和葡聚糖凝膠離子交換劑三大類。
親水性葡聚糖凝膠是由一定分子量的葡聚糖(右旋糖酐，dextran)懸浮于有機相中，加入交聯劑表氯醇使葡聚糖交聯聚合而成，其商品名為Sepha—dex。
加入交聯劑量不同可制成不同交聯度的凝膠，因此其應用范圍也有所不同。
不同交聯度商品凝膠的吸水程度及應用范圍等情況見表2-3。
制備凝膠薄層時與一般薄層有所不同，首先用于薄層色譜的凝膠顆粒要細(小于40um)，交聯度要低(G-50以下)。
因交聯度大的凝膠不易制板。此外，在制備凝膠薄層時還應注意以下幾點。
①凝膠預先必須用水或緩沖液浸泡，使之充分膨脹后，經放置沉降，再傾去上層浸泡液即可鋪制薄層，不需黏合劑，但玻璃板必須潔凈，否則鋪不好。
②鋪好的濕薄層需置于特制的展開槽中，薄層的上、下兩端連上厚濾紙條，以下行法(薄層與水平約成20°角)從薄層上端將展開劑引到薄層上，使薄層飽和或達到平衡(約需12h)，然后洗脫液由薄層下端流人儲液槽內。
③薄層達到平衡后，需通過展開槽蓋上的小孔點樣品溶液。
④由于凝膠薄層一直為潮濕狀態，所以展開劑的前緣不容易察見。
⑤展開速度很慢，一般不超過4cm/h。
葡聚糖凝膠只能用于水溶性物質，但在葡聚糖分子上引入有機基團，則可使之成為親脂性葡聚糖凝膠。
如在G-25凝膠上引入羥丙基基團，與糖分子以醚鍵相連，使之成為既有親水性又有親脂性的LH-20葡聚糖凝膠，適用于有機物，如黃酮、蒽醌、色素等成分的分離。
葡聚糖凝膠離子交換劑在G-25或G-50葡聚糖凝膠上引入羧甲基、磺乙基、磺丙基(SP，一C3H7SO3H)、二乙基氨乙基及季銨乙基等制成的既具有凝膠的優點又具離子交換性質的載體，在生化及天然化合物方面得到廣泛應用。
這些離子交換劑在水、鹽溶液、弱堿溶液、弱酸溶液及有機溶液中較穩定，但在強酸溶液中易水解，所以應避免在pH值小于2的溶液中操作。
三、凝膠色譜中對流動相的要求
凝膠薄層常用于高分子的非離子化合物的分離，如蛋白質及核酸等，用此法可以分離不同分子量的混合樣品，常用的展開劑是水或鹽類的水溶液、緩沖液等。
在凝膠薄層展開劑中常加入適量的鹽類，以保持其離子強度，避免在離子型樣品通過凝膠薄層時導致凝膠收縮及滲透率減低。
第五節 其他薄層色譜
一、微乳薄層色譜法
與一般常用的薄層色譜法不同，微乳薄層色譜法是以微乳液為流動相的薄層色譜法。
微乳液是將不同配比的表面活性劑、助表面活性劑、油、水等組分組合在一起，使其自發生成一種無色透明、各向同性、低黏度的溶液，屬于締合膠體溶液。
微乳體系的組成與膠束體系相似，但比膠束體系具有更大的增溶量。
微乳液具有更大的增溶量和更低的界面張力，更有利于提高色譜效率。
在微乳薄層層析過程中，溶質在固定相、微乳液的水連續相及油核和界面膜數相之間產生不同比率的分配，由于微乳液的增溶作用，極性大的分子分配于微乳水連續相中，極性小的分子分配于微乳油核或穿插排列于表面活性劑與助表面活性劑組成的膜柵欄中，加上吸附、靜電、疏水、立體等其他多種綜合的效應，使混合組分在微乳液中展開時遷移速度不同，使其具有獨特的選擇性，可同時分離親水物質和疏水物質。此外，本法對帶電成分和非帶電成分亦有較好的分離選擇，適用于分離差別很小的物質。
二、膠束薄層色譜法
膠束色譜是一類應用一定濃度的表面活性劑溶液所形成的膠束溶液作為流動相的色譜。
自1979年美國科學家Armstrong首次采用膠束薄層色譜法成功地分離測定農藥后，膠束色譜法在理論和實踐上均取得了顯著進展。
表面活性劑分子的化學結構包括親水基和疏水基，如十二烷基硫酸鈉。
在極性溶劑如水中，由于和極性親水基(硫酸基)之間有排斥作用，非極性疏水基(烷基長鏈)之間有締合作用，故幾十個表面活性劑分子聚合成團，形成親水基向外、疏水基向內的正膠束;而在非極性溶劑中情況則相反，極性基團聚集成親水性內核，而親脂性的非極性基團向著外部的有機溶劑，形成逆膠束。
正膠束溶液對于原來不溶或微溶于水的有機化合物有增溶作用。
對于苯、甲苯這類非極性分子，由于分子溶解在膠束的親脂性內核中，故溶解度增加;對于水楊酸、酚類等稍帶極性的分子，分子的非極性部分插入膠束內核，極性部分伸在外層親水基團中間，結果同樣造成增溶;而羧基苯甲酸這種強極性分子，則可吸附在膠束的親水基表面而得到增溶。
由于膠束的增溶作用，用膠束溶液作為色譜流動相時，原來組分在液固兩相間的分配變成了組分在膠束、水相和固定相三相問的分配平衡。
各組分之間因分配系數不同，而達到分離。
膠束薄層色譜根據所用膠柬溶液的不同又可分為正膠束薄層和逆膠束薄層。
正膠束薄層一般采用聚酰胺、氧化鋁、硅膠作固定劑，表面活性劑的水溶液，如十二烷基硫酸鈉水溶液等作展開劑，而逆膠束薄層一般采用硅烷化的硅膠作固定相，表面活性劑的有機溶液加入少量水，如丁二酸二辛酯磺酸鈉的環己烷溶液中加入少量水后作展開劑，可解決其分離效率不高或斑點略有拖尾等問題。
采用正膠束薄層色譜，可以用膠束溶液代替有機溶液展開分離許多原來在水中不溶或微溶的藥物，既可避免使用揮發性大、對人體有害的有機溶劑，又能降低成本。
膠束色譜還可用于薄層掃描，又稱為膠束薄層色譜掃描法;類似的還有膠束高效液相色譜和膠束電動毛細管色譜。
膠束高效液相色譜大多采用反相色譜柱LC-18、LC-CN等，流動相多用SDS水溶液或用其他表面活性劑水溶液。
用膠束高效液相色譜分析血漿樣品時，因血漿蛋白大分子不能像脂溶性藥物小分子一樣進入膠束內部，故會首先洗脫出峰。
因此采用膠束色譜能使體液樣品不經前處理直接進樣。
膠束色譜的這種特點已在生物樣品中的藥物及代謝物測定上得到了廣泛應用。
膠束電動毛細管色譜是一種基于膠束增溶和電泳移動的新型色譜。
當樣品進入毛細管后，在水相和膠束相中進行分配，在水相中分配較多的組分移動速度快，在膠束相中分配較多的組分移動速度慢。
因此，各種組分可以根據它們在兩相中分配不同而得到分離。
膠束電動毛細管色譜的特點在于它彌補了普通電泳法不能分離中性化合物的不足，可用于許多電中性藥物的分離測定。
三、反相薄層色譜法
反相薄層色譜是利用化學鍵合反應，將烴基硅烷鍵合到硅膠表面，制成非極性固定相，用極性較大的液體作流動相進行分離分析的方法，可克服疏水板對溶劑、系統的限制，其流動相含水量根據鍵合相不同可達20%～80%不等。
常用展開劑是水和甲醇混合溶劑，其次是水和乙腈，并可使用強酸或強堿作流動相。
本法可用于極性、極性化合物的分離，甚至水溶性化合物的分離。
并可按理論和預期方法選用溶劑系統，因為Rf值與流動相中的有機改性劑含量之間呈線性關系。
本法回收率高，重現性好，薄板可重復使用
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