13種蛋白濃縮方法的應(yīng)用過(guò)程需知

蛋白濃縮在免疫學(xué)中應(yīng)用廣泛，蛋白濃縮的方法數(shù)數(shù)還不少：聚乙二醇沉淀法、冷凍干燥濃縮法、超濾膜濃縮法、有機(jī)溶劑沉淀法……那么，這些方法用的時(shí)候該注意哪些問(wèn)題呢？

1、丙酮沉淀法：三氯醋酸沉淀法試驗(yàn)要求的儀器簡(jiǎn)單，但是常常導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。

2、免疫沉淀法：得有特異性抗體

3、硫酸銨沉淀法：利用高濃度鹽將蛋白質(zhì)析出(鹽析)，選擇硫酸按是因?yàn)椋蝴}析有效性，pH范圍廣，溶解度高，溶液散熱少，經(jīng)濟(jì)，大多數(shù)的蛋白都可以用資格方法

4、聚乙二醇沉淀法：使用PEG時(shí)旨在個(gè)別情況下才會(huì)是蛋白質(zhì)稍有變性!他溶解是散熱低，形成沉淀的平衡時(shí)間短，通常達(dá)到30%時(shí)蛋白質(zhì)就會(huì)達(dá)到最大量的沉淀!

5、離子交換層析：可用陰離子交換樹脂進(jìn)行濃縮。

6、透析袋濃縮法：利用透析袋濃縮蛋白質(zhì)溶液是應(yīng)用最廣的一種。將要濃縮的蛋白溶液放入透析袋(無(wú)透析袋可用玻璃紙代替)，結(jié)扎，把高分子(6 000-12 000)聚合物如聚乙二醇(碳蠟)、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可將吸水劑配成30%-40%濃度的溶液，將裝有蛋白液的透析袋放入即可。吸水劑用過(guò)后，可放入溫箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。

主要用于更換蛋白質(zhì)的緩沖液，得有透析袋。不需要特殊的儀器 。一般用得是PEG20000進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，簡(jiǎn)單，快速，對(duì)蛋白沒(méi)什么影響

7、冷凍干燥濃縮法：這是濃縮蛋白質(zhì)的一種較好的辦法，它既使蛋白質(zhì)不易變性，又保持蛋白質(zhì)中固有的成分。它是在冰凍狀態(tài)下直接升華去除水分。具體做法是將蛋白液在低溫下冰凍，然后移置干燥器內(nèi)(干燥器內(nèi)裝有干燥劑，如NaOH、CaCl2和硅膠等)。密閉，迅速抽空，并維持在抽空狀態(tài)。數(shù)小時(shí)后即可獲得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白質(zhì)保存方便，應(yīng)用時(shí)可配成任意濃度使用。也可采用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。

8、吹干濃縮法：將蛋白溶液裝入透析袋內(nèi)，放在電風(fēng)扇下吹。此法簡(jiǎn)單，但速度慢，且溫度不能過(guò)高，最好不要超過(guò)15 ℃。

9、超濾膜濃縮法：此法是利用微孔纖維素膜通過(guò)高壓將水分濾出，而蛋白質(zhì)存留于膜上達(dá)到濃縮目的。有兩種方法進(jìn)行濃縮：一種是用醋酸纖維素膜裝入高壓過(guò)濾器內(nèi)，在不斷攪拌之下過(guò)濾;另一種是將蛋白液裝入透析袋內(nèi)置于真空干燥器的通風(fēng)口上，負(fù)壓抽氣，而使袋內(nèi)液體滲出。

10、凝膠濃縮法：選用孔徑較小的凝膠，如SephadexG25或G50，將凝膠直接加入蛋白溶液中。根據(jù)干膠的吸水量和蛋白液需濃縮的倍數(shù)而稱取所需的干膠量。放入冰箱內(nèi)，凝膠粒子吸水后，通過(guò)離心除去。

11、濃縮膠濃縮法：濃縮膠是一種高分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的有機(jī)聚合物，具有很強(qiáng)的吸水性能。每克干膠可吸水120 ml～150 ml。它能吸收低分子量的物質(zhì)，如水、葡萄糖、蔗糖、無(wú)機(jī)鹽等，適宜濃縮10 000分子量以上的生物大分子物質(zhì)。濃縮后，蛋白質(zhì)的回收率可達(dá)80%～90%。比濃縮膠應(yīng)用方便，直接加入被濃縮的溶液中即可。必須注意，濃縮溶液的pH值應(yīng)大于被濃縮物質(zhì)的等電點(diǎn)，否則在濃縮膠表面產(chǎn)生陽(yáng)離子交換，影響濃縮物質(zhì)的回收率。

12、鹽析法：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。一般來(lái)說(shuō)，所有固體溶質(zhì)都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出，這一過(guò)程叫鹽析。如硫酸銨沉淀法。

13、有機(jī)溶劑沉淀法：有機(jī)溶劑的沉淀機(jī)理是降低水的介電常數(shù)，導(dǎo)致具有表面水層的生物大分子脫水，相互聚集，最后析出。

該法優(yōu)點(diǎn)在于：

（1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀;

（2）沉淀不用脫鹽，過(guò)濾較為容易;

（3）在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛。其缺點(diǎn)是對(duì)具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作要求在低溫下進(jìn)行。

總體來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)和酶的有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。

有機(jī)溶劑的選擇首先是能和水混溶，使用較多的有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇、丙酮，還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。

有多種因素影響有機(jī)溶劑的沉淀效果：

（1）溫度：低溫可保持生物大分子活性，同時(shí)降低其溶解度，提高提取效率;

（2）樣品濃度和PH：與鹽析法中的作用基本相同;

（3）金屬離子：一些多價(jià)陽(yáng)離子如Zn2+和Ca2+在一定PH下能與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，這種復(fù)合物在水中或有機(jī)溶劑中的溶解度都大大下降，而且不影響蛋白質(zhì)的生物活性。

（4）離子強(qiáng)度：鹽濃度太大或太低都對(duì)分離有不利影響，對(duì)蛋白質(zhì)和多糖而言鹽濃度不超過(guò)5%比較合適，使用的乙醇量不超過(guò)二倍體積為宜。

強(qiáng)調(diào)低溫(0-4度以下)是因?yàn)?0度時(shí)蛋白會(huì)在有機(jī)溶劑中變性，可用乙醇，丙酮……注意：Mg離子，pH值

有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法應(yīng)用普遍，溫馨提示：在十度以下的條件下，蛋白質(zhì)會(huì)在有機(jī)溶劑中變性，這時(shí)要注意選用合適的有機(jī)溶劑：如乙醇，丙酮，還有，注意：鎂離子和pH值 。

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