粉防己生物堿的提取分離與鑒定
漢防己為防己科千金藤屬物Stephania tetrandra S. Mcore的根，是祛風(fēng)解熱鎮(zhèn)痛藥物，其有效成分為生物堿。主要是漢防己甲素和漢防已乙素。臨床上除用作治療高血壓、神經(jīng)性疼痛、抗阿米巴原蟲外，還將粉防已生物堿的碘甲基、或溴甲基化合物作為肌肉松弛劑應(yīng)用，此外漢防已甲素在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有抗癌和擴(kuò)張血管的作用。
目的要求
通過漢防己中幾種生物堿的提取分離和鑒定，要求掌握下列知識(shí)和技能。
1． 生物堿的一般提取方法。
2． 用低壓柱層析分離，純化單體的方法及薄層層析鑒定
已知生物堿的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)
漢防已根中總生物堿含量為1.5~2.3%，主要為漢防已甲素，含量約1%，漢防已乙素，含量約0.5%；輪環(huán)藤酚堿，含量為0.2%；以及其它數(shù)種微量生物堿。
1．漢防已甲素（Tetrandrine，漢防已堿，粉防已堿）
無色針晶，不溶于水和石油醚，易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和氯仿等有機(jī)溶劑及稀酸水中，可溶于苯，mp 216℃，有雙熔點(diǎn)現(xiàn)象，自丙酮中結(jié)晶者，150℃左右熔后加熱又固化，至213℃復(fù)熔。
2．漢防已乙素（Fangchinoline, 又稱防已諾林堿，去甲粉防已堿）
溶解行為與漢防已甲素相似，因有一個(gè)酚羥基，故極性較漢防已甲素稍高，在苯中的溶解度小于漢防已甲素而在乙醇中又大于漢防已甲素。籍此可以相互分離，用不同溶劑重結(jié)昌時(shí)，其晶形和溶點(diǎn)不同：
3．輪環(huán)藤酚堿（Cylanoline）
為水溶性季銨生物堿，不溶于極性溶劑，氯化物為無色，八面體狀結(jié)昌，mp 214~6℃，碘化物為無色絹絲狀結(jié)晶，mp185℃；苦味酸鹽為黃色結(jié)晶，mp154~6℃。
生物堿的提取分離
1．總生物堿的提取和親脂性與親水性生物堿的分離
注一：將漢防已粗粉加適量酸水液，以能將生藥粉末潤濕為度（約150ml），充分拌勻，放置半小時(shí)，均勻而致密地裝入滲筒內(nèi)，用錐形瓶底部或其它平底工具壓緊，供滲漉用，流速約1.5ml/分。
注二：凈砂必須事前洗凈烘干，拌和量最好不要超過120g，以免索氏提取器一次裝不下或裝得過多。提不盡生物堿。
注三：檢查生物堿是否提盡的方法，是取最后一次乙醚提取液約數(shù)滴，揮去乙醚，殘?jiān)?%HCl 0.5ml溶解后，加改良碘化鉍鉀試劑一滴，無沉淀折出或明顯渾濁時(shí)，表明生物堿已提盡，或基本提盡。反之，應(yīng)繼續(xù)提取。
注四：先將提取器內(nèi)濾紙筒取出。然后將提取玻筒內(nèi)最后一次乙醚提取液傾出（另器貯存），再將提取玻筒安裝好，繼續(xù)加熱，回收燒瓶中乙醚于玻筒中，至燒瓶內(nèi)的乙醚提取液體積較小時(shí)，停止回收，將燒瓶中乙醚提取液傾出。
2．低壓柱層析分離漢防已甲素和乙素
低壓柱層析在低壓下（0.5~3kg/cm2，一般0.3~1.2 kg/cm2）采用顆粒直徑介于經(jīng)典柱層析（100~200μm）和HPLC（~37μm）之間的薄層層析用硅膠（或氧化鋁）H或G（50~75μm）作為填充劑的一種柱層析柱，其基本原理與HPLC相同，分離效果也介于經(jīng)典柱與HPLC之間，用減壓干法裝柱，鋪層緊密均勻，層析帶分布集中整齊，同時(shí)薄層層析的最佳分離溶劑系統(tǒng)可以直接用于低壓柱層析，它是一種分離效果較好，設(shè)備簡單，操作方便，快速的方法。適宜和于天然產(chǎn)物的常量制備性分離。
（1）裝柱 減壓干法裝法，層析柱規(guī)格：柱長30cm，內(nèi)徑2cm，共裝硅膠約30g（高約22cm）。
（2）拌樣加樣 取漢防已堿約150mg，加少量丙酮熱溶（剛?cè)転槎龋┯玫喂芗拥?.5g硅膠上，仔細(xì)拌勻，水浴上蒸干，碾細(xì)，通過一個(gè)長頸漏斗小心加在柱頂，輕輕垂直頓擊，待樣品表面平整不拌動(dòng)時(shí)，上面再蓋約1~2cm高的空白硅膠，再加蓋一園形濾紙片，壓緊。
（3）洗脫 先檢查從空壓機(jī)至層析柱各閥門管道是否正常，關(guān)緊各個(gè)閥門，開動(dòng)空壓機(jī)至額定壓力（5.8kg/cm2）待用。用滴管順層析柱柱壁仔細(xì)加入少量洗脫劑（環(huán)已烷-慚酸乙酯-二乙胺/6：2：0.8），當(dāng)液面達(dá)到一定高度時(shí)，再一次加入其余洗脫劑（共約250ml），迅速在柱頂上裝上玻璃標(biāo)口塞接頭，用鐵夾壓緊（防加壓時(shí)接頭沖開），小心開啟空壓機(jī)閥門，再開針形閥和空氣過濾減壓器，（注意：壓力過大。玻璃柱會(huì)炸，一般2kg是安全的，必要時(shí)可戴防護(hù)面罩）調(diào)動(dòng)所需壓力，0.6~1.2kg/cm2，約40分鐘后流出，控制流速1ml/分，每10分鐘左右一管，收12~15份，洗脫全過程約3小時(shí)。
（4）檢查 各流份分別移入小玻璃蒸發(fā)器中，于水浴上濃縮，分別通過TLC檢查，吸附劑：硅膠G，展開劑：環(huán)已烷-乙酸乙酯-二乙胺/6：3：1，改良碘化鉍鉀試劑噴霧顯色，以漢防已甲素、乙素為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，合并相同組分，分別獲得甲、乙素粗品，用丙酮重結(jié)晶，測(cè)定mp。
鑒定方法
1．衍生物制備
取漢防已甲素0.2g，溶于2ml（丙酮中，滴加苦味酸飽和水溶液至不再折出黃色沉淀為止，抽濾收集沉淀，順次以少量水乙醚洗滌，乙醇重結(jié)晶，得漢防已甲素苦味酸鹽，mp 235~242℃（dc）。
2．有機(jī)胺堿的TLC
吸附劑：青島海洋化工廠薄層層析硅膠G，用0.3%CMC-Na水液制板，110℃活化1小時(shí)。
樣品：分出的漢防已甲素①、乙素②、總堿③
展開劑：環(huán)己烷- EtoAc-NHEt2（6：2：1）
顯色劑：改良碘化鉍鉀試劑（展開后用電吹風(fēng)吹干再噴顯色劑，以免二乙胺干擾）
現(xiàn)象：甲素顯色后呈淡棕色，2小時(shí)左右就褪色，而乙素呈棕色，久置不褪色，可幫助其辨認(rèn)。
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