UPLC（超高效液相色譜）簡(jiǎn)介

超越HPLC

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)液相色譜技術(shù)的要求也不斷提高，單從技術(shù)角度的改進(jìn)已經(jīng)不行。這就需要同時(shí)從科學(xué)與技術(shù)的角度出發(fā)，或者說(shuō)從理論高度對(duì)液相色譜重新認(rèn)識(shí)。因此，UPLC（超高效液相色譜）概念得以提出，將HPLC的極限作為自己的起點(diǎn)。

在1996年，Waters公司推出Alliance HPLC時(shí)的主要目標(biāo)是提高液相色譜的"精度"。當(dāng)時(shí)多數(shù)公司都認(rèn)為HPLC技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到極致了、而同時(shí)用戶對(duì)性能沒(méi)有更高的需求，因此HPLC的目標(biāo)應(yīng)該是降低成本、走向更低的價(jià)格以獲得更廣泛的應(yīng)用。

針對(duì)這樣的觀念，Waters公司提出：HPLC的技術(shù)沒(méi)有到達(dá)極限，用戶對(duì)HPLC有更高的要求，HPLC精度的提高對(duì)更好、更可靠的結(jié)果有極大的益處，對(duì)法規(guī)的遵從也是一個(gè)極大的促進(jìn)。

站在當(dāng)今世界科技前沿的液相色譜用戶現(xiàn)在又有了新的需求。

首先是改進(jìn)生產(chǎn)力的需求，因?yàn)榇罅康臉悠沸枰诤芏痰臅r(shí)間內(nèi)完成，例如代謝組學(xué)分析；

其次是在生化樣品及天然產(chǎn)物樣品的分析中，樣品的復(fù)雜性對(duì)分離能力提出了更高的要求；

第三是在與MS及MS/MS等檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用時(shí)，對(duì)連接的質(zhì)量提出了更高的要求。

簡(jiǎn)而言之，我們需要"更快地得到更好的結(jié)果"。

今天我們發(fā)現(xiàn)，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)液相色譜技術(shù)的要求也不斷提高，單從技術(shù)角度的改進(jìn)已經(jīng)不行。這就需要同時(shí)從科學(xué)與技術(shù)的角度出發(fā)，或者說(shuō)從理論高度對(duì)液相色譜重新認(rèn)識(shí)。因此UPLC（超高效液相色譜）概念的提出也就十分自然。簡(jiǎn)而言之，UPLC是用HPLC的極限作為自己的起點(diǎn)。

理論基礎(chǔ)

早在1956年，J.J van Deemter就發(fā)表了他著名的理論：van Deemter曲線及其方程式。最早這個(gè)理論是用在氣相色譜上的，但是后來(lái)出現(xiàn)的液相色譜上也能應(yīng)用這個(gè)理論。Waters公司引入U(xiǎn)PLC的概念就是由研究這個(gè)著名的方程式開(kāi)始。

首先探討一下這個(gè)著名的方程式。如果只關(guān)心理論塔板高度（H）與流速（線速度；u）及填料顆粒度（dp）之間的關(guān)系，就可以把該方程式作如下的簡(jiǎn)化：

其中，A項(xiàng)代表了顆粒度和柱床填裝的優(yōu)良程度；B項(xiàng)代表了軸向擴(kuò)散；而C項(xiàng)則代表了傳質(zhì)。從不同顆粒度的曲線中我們可以看到圖1所示的現(xiàn)象：

首先顆粒度越小柱效越高；其次每個(gè)顆粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速；

最后，更小的顆粒度使最高柱效點(diǎn)向更高流速（線速度）方向移動(dòng)，而且有更寬的線速度范圍。

所以降低顆粒度不但提高柱效，同時(shí)也提高速度。使用更高的流速會(huì)受到色譜柱填料耐壓及儀器耐壓的限制。

反之，如果不用到最佳流速，小顆粒度填料的高柱效就無(wú)法體現(xiàn)。另外，更高的柱效需要更小的系統(tǒng)體積（死體積）、更快的檢測(cè)速度等一系列條件的支持，否則小顆粒度填料的高柱效同樣無(wú)法充分體現(xiàn)。

因此，要真正創(chuàng)建一個(gè)全新的分離科學(xué)領(lǐng)域 －UPLC，必須解決以下問(wèn)題：

■ 大幅提高色譜柱的性能；第一要解決小顆粒填料的耐壓?jiǎn)栴}，第二要解決小顆粒填料的裝填問(wèn)題，包括顆粒度的分布以及色譜柱的結(jié)構(gòu)。

■高壓溶劑輸送單元（超過(guò)15000psi）。

■ 完善的系統(tǒng)整體性設(shè)計(jì)，降低整個(gè)系統(tǒng)的體積，特別是死體積。并解決超高壓下的耐壓及滲漏問(wèn)題。

■ 快速自動(dòng)進(jìn)樣器，降低進(jìn)樣的交叉污染。

■ 高速檢測(cè)器；優(yōu)化流動(dòng)池以解決高速檢測(cè)及擴(kuò)散問(wèn)題。

■ 系統(tǒng)控制及數(shù)據(jù)管理，解決高速數(shù)據(jù)的采集、儀器的控制問(wèn)題。

新型色譜填料及裝填技術(shù)

UPLC分離只有在新型的、耐壓而且顆粒度分布范圍很窄的1.7顆粒填料合成出來(lái)之后才有可能。色譜柱技術(shù)應(yīng)該涵蓋幾個(gè)方面的內(nèi)容：

首先是填料的合成，以得到高質(zhì)量的填料顆粒，包括耐高壓、耐酸堿等等。

其次是顆粒的篩選，選出顆粒度分布盡可能窄的填料。

最后是裝填技術(shù)，以保證即堵住顆粒不使其外流，又不至于引起反壓的大幅升高。

Waters公司利用1999年發(fā)明的雜化顆粒技術(shù)（Hybrid Particle Technology － HPT），合成了第二代有機(jī)硅填料。它使用雙（三乙氧基硅）乙烷在硅膠中形成橋式乙基基團(tuán)。這樣合成出來(lái)的填料在其內(nèi)部有了更多的"交聯(lián)"結(jié)構(gòu)，其機(jī)械強(qiáng)度有了極為顯著的提高，耐壓超過(guò)了20000psi。

使用這項(xiàng)技術(shù)，Waters公司合成了低于2顆粒度的填料―― 1.7顆粒度的"ACQUITY UPLCTM"填料。為了得到更好的耐壓能力及傳質(zhì)作用，還優(yōu)化了該填料的孔體積及孔徑。

傳統(tǒng)色譜柱填料的裝填技術(shù)受兩個(gè)方面的影響，導(dǎo)致現(xiàn)有小顆粒填料色譜柱的性能及質(zhì)量均不能令人滿意。

首先是其顆粒度分布一般較寬，例如，5顆粒度填料中會(huì)有大量的4以下及6以上的顆粒，

因此，通常使用2篩板在色譜柱的出口攔截填料，阻止其外漏。

其次，如果使用低于2的篩板，篩板的反壓升高很快，甚至超過(guò)了填料所產(chǎn)生的反壓。因此，目前大多數(shù)3.5、2.5或更低顆粒度的填料還是使用2的篩板，只是在柱頭裝填一小段5的填料。因此現(xiàn)有小顆粒度填料的色譜柱與理論或理想狀態(tài)相距甚遠(yuǎn)。

Waters公司的ACQUITY UPLCTM使用了更嚴(yán)格的篩分技術(shù)使1.7填料的分布很窄，并且使用了全新篩板（專利申請(qǐng)中）及其他色譜柱硬件（柱管及其連接件），在超過(guò)20000psi的壓力下裝填。Waters公司為此安裝了一條新的色譜柱裝填生產(chǎn)線及新的測(cè)試設(shè)備。因此，ACQUITY UPLCTM色譜柱的性能及質(zhì)量有了質(zhì)的飛躍。

填料的合成技術(shù)、顆粒的篩分技術(shù)、篩板及色譜柱硬件技術(shù)的提高，在更高的壓力下裝填色譜柱是UPLC色譜柱性能、質(zhì)量保證的關(guān)鍵。

超高壓液相色譜泵

Waters公司具備制造超高壓泵的能力，UNC的Groove教授所用的超高壓液相色譜泵是Waters公司為其特別制造的。除了密封、高壓動(dòng)力之外，超高壓色譜泵主要解決的問(wèn)題是超高壓下溶劑的壓縮性及絕熱升溫（Adiabatic Heating）。

ACQUITY UPLCTM裝備一******立柱塞驅(qū)動(dòng)、四個(gè)溶劑切換的兩元高壓梯度泵，其1ml/min流速時(shí)的耐壓可達(dá)15000psi，具有精確、可靠的梯度性能。新型的超高壓輸液泵使獨(dú)特的小顆粒填料技術(shù)可以在最優(yōu)化的流速下工作，以充分發(fā)揮其特點(diǎn)。

集成改進(jìn)的真空脫氣技術(shù)，使四個(gè)流動(dòng)相溶劑及兩個(gè)進(jìn)樣器洗針溶劑同時(shí)得到良好的脫氣。其梯度的重現(xiàn)性也非常好，盡管保留時(shí)間在1min以內(nèi)，其重現(xiàn)性卻與HPLC的重現(xiàn)性不相上下。

自動(dòng)進(jìn)樣器

為了降低死體積、減少交叉污染，自動(dòng)進(jìn)樣器的設(shè)計(jì)使用了許多新技術(shù)，例如針內(nèi)針樣品探頭（XYZZ’）、壓力輔助進(jìn)樣等等。所謂"針內(nèi)針"的XYZZ’設(shè)計(jì)，實(shí)際上就是使用液相色譜管路（PEEK材料）充當(dāng)進(jìn)樣針以減少死體積，而"外針"是一小段硬管，用來(lái)扎破樣品瓶蓋。

壓力輔助進(jìn)樣在如此小的儀器的系統(tǒng)體積下保證可靠、重現(xiàn)的進(jìn)樣是非常重要的措施。為了降低交叉污染，采用了一強(qiáng)、一弱的雙溶劑的進(jìn)樣針清洗步驟，這兩個(gè)洗針溶劑也采取了脫氣措施。

高速檢測(cè)器

然而，在新的色譜柱技術(shù)支持下的高壓、高速UPLC對(duì)ACQUITY UPLCTM結(jié)果的檢測(cè)提出了挑戰(zhàn)。首先是速度問(wèn)題，在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)如此多的色譜峰需要更快的數(shù)據(jù)采集速率相適應(yīng)，至少要在10Hz以上，還需要降低樣品在檢測(cè)池內(nèi)的駐留時(shí)間。當(dāng)然同普通的HPLC檢測(cè)器一樣，信噪比也是新型檢測(cè)器的追求目標(biāo)。

盡管因需要降低擴(kuò)散而不得不使用很小體積的檢測(cè)池（<1），但是仍然要設(shè)法提高光能量通過(guò)及傳輸來(lái)降低噪音。同時(shí)必須使用更快的采樣速率、非常小的時(shí)間常數(shù)值，以適應(yīng)UPLC所產(chǎn)生的非常窄的色譜峰。

ACQUITY UPLCTM使用新型光纖引導(dǎo)、Teflon AF池壁的流動(dòng)池；10mm的光程（與普通HPLC相同）而體積只有500nL（普通HPLC的20分之一）。光束通過(guò)光纖完全引入流動(dòng)池后，利用Teflon AF的特征在池壁內(nèi)全折射，不損失光能量；同時(shí)采樣速率達(dá)到40點(diǎn)/s。

這樣設(shè)計(jì)的高速檢測(cè)器不但適應(yīng)了UPLC高速及高分辨率的特征，而且還對(duì)UPLC靈敏度的提高有很大的幫助。

優(yōu)化系統(tǒng)綜合性能的設(shè)計(jì)

Waters ACQUITY Ultra Performance LCTM系統(tǒng)的整體設(shè)計(jì)優(yōu)化了超低系統(tǒng)體積及死體積，使之能獲得成功的UPLC所必須的低擴(kuò)散、高速檢測(cè)所帶來(lái)的所有優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還可以充分利用質(zhì)譜電噴霧離子化接口的優(yōu)點(diǎn)。

由于這個(gè)原因，ACQUITY UPLCTM系統(tǒng)會(huì)是理想的質(zhì)譜接口。

當(dāng)連接了我們的質(zhì)譜技術(shù)時(shí)，ACQUITY UPLCTM系統(tǒng)的解決方案可以提供更靈敏的LC/MS及LC/MS/MS分析。例如；當(dāng)與Micromass?LCT PremierTM連接時(shí)，數(shù)據(jù)的質(zhì)量與速度有了驚人的改進(jìn)。

應(yīng)用

由于超高效液相色譜（UPLC）是一個(gè)新興的領(lǐng)域，Waters的ACQUITY UPLCTM系統(tǒng)也是剛剛出現(xiàn)，因此目前已發(fā)表的應(yīng)用資料還很缺乏。與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。

因此首先想到的UPLC應(yīng)用是代謝組學(xué)分析及其他一些生化領(lǐng)域。其他目前能夠想到的應(yīng)用領(lǐng)域還包括天然產(chǎn)物的分析。使用UPLC與Tof或Q-Tof等質(zhì)譜檢測(cè)器連接，會(huì)對(duì)天然產(chǎn)物分析，特別是中藥研究領(lǐng)域的發(fā)展是一個(gè)極大的促進(jìn)。

多數(shù)生化樣品及天然產(chǎn)物都十分復(fù)雜，能被分離的色譜峰再多也會(huì)覺(jué)得不夠。圖3是多肽指紋圖的HPLC與UPLC兩個(gè)色譜圖（紫外檢測(cè)）比較。

在同樣條件下，UPLC能分離的色譜峰比HPLC多出一倍還多，因此我們有可能進(jìn)一步研究：保持分離度而追求更快的分析速度，在相同時(shí)間內(nèi)作更多的樣品，或優(yōu)化分離度在同樣時(shí)間內(nèi)再分出更多的色譜峰。

在提到"蛋白組學(xué)"或"代謝組學(xué)"時(shí)，與沒(méi)有"組"的差別從分析的角度說(shuō)就是樣品量極大，需要在短時(shí)間分析成千上萬(wàn)的樣品。UPLC不損失分離度的高速度優(yōu)點(diǎn)在這里就能充分體現(xiàn)。

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