基因治療的基本程序
基因治療是在基因工程基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)，它相對(duì)于現(xiàn)有其它治療方法較為復(fù)雜。基因治療的基本過(guò)程包括以下主要方面：
（一）目的基因的選擇和制備
基因治療的首要問(wèn)題是選擇用于治療疾病的目的基因。對(duì)遺傳病而言只要已經(jīng)研究清楚某種疾病的發(fā)生是由于某個(gè)基因的異常所引起的，其野生型基因就可被用于基因治療，如用ADA基因治療ADA缺陷病。但在現(xiàn)在的條件下，僅此是不夠的。
可用于基因治療的基因需滿足以下幾點(diǎn)：
在體內(nèi)僅有少量的表達(dá)就可顯著改善癥狀；該基因的過(guò)高表達(dá)不會(huì)對(duì)機(jī)體造成危害。很顯然某些激素類(lèi)基因如與血糖濃度相關(guān)的胰島素基因目前尚不能用于 糖尿病 的基因治療。
在抗病毒和病原體的基因治療中，所選擇的靶基因應(yīng)在病毒和病原體的生活史和起重要的作用并且該序列是特異的，如針對(duì)HBV的HBeAg或X基因等。
腫瘤病人多有免疫缺陷，可選用免疫因子基因轉(zhuǎn)入人體，腫瘤細(xì)胞內(nèi)往往存在多種基因異常形式，可采用反義技術(shù)封閉細(xì)胞內(nèi)活化的癌基因或向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入野生型抑癌基因，抑制腫瘤生簪，所針對(duì)的癌基因或抑癌基因應(yīng)下該腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有明確的相關(guān)性。
在確定欲選目的基因后，就在制備目的基因。正向表達(dá)的基因可以是cDNA（complementary DNA），也可是 基因組 DNA(genomic DNA)片段。可用傳統(tǒng)的方法獲取，也可采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction PCR)等新技術(shù)進(jìn)行體外擴(kuò)增。部分反義基因也可采用此法獲得，但多數(shù)情況下采用人工合成的方式制備。
（二）基因的轉(zhuǎn)運(yùn)
目前已有多種基因轉(zhuǎn)運(yùn)的方式，其基本原則是將外源基因運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。已使用的有病毒 載體 和非病毒 載體 兩大類(lèi)。
病毒 載體 ：病毒具有一些獨(dú)特的性質(zhì)如多數(shù)病毒可感染特異的細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)不易降解；RNA病毒能整合到染色體以及基因水平較高等。因此病毒載體是良好的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。目前已被用作載體的病毒有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)的病毒。皰疹病毒和肝炎病毒等。逆轉(zhuǎn)錄病毒用作載體時(shí)需進(jìn)行幾步改造：
（1）將天然的野生型RNA前病毒轉(zhuǎn)變成DNA載體，并插入欲轉(zhuǎn)移的相關(guān)外源基因。其基本原則是用標(biāo)記基因和外源基因替代病毒的編碼基因。
（2）制備輔助細(xì)胞為載體DNA提供其喪失的功能。
（3）將載體DNA導(dǎo)入輔助以產(chǎn)生病毒載體。
（4）病毒載體感染靶細(xì)胞，外源基因在細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá)。
非病毒載體：這類(lèi)載體的發(fā)展較快，目前主要是脂質(zhì)體，一些具有受體功能的載體也呈現(xiàn)出誘人的前景，關(guān)于常見(jiàn)載體的優(yōu)缺點(diǎn)列于表2。
表23－2 常見(jiàn)基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的優(yōu)缺點(diǎn)
| 載體 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
| 逆轉(zhuǎn)錄病素毒 | 基因組小并且簡(jiǎn)單 可穩(wěn)定整合于宿主基因組 生物學(xué)特性清楚 可高效轉(zhuǎn)入復(fù)制中的細(xì)胞 對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)害 | 僅感染分裂細(xì)胞 隨機(jī)整合（可能導(dǎo)致突變） 常常只有短暫表達(dá) 病毒滴度低（107pfu/ml） 可能會(huì)與有復(fù)制能務(wù)的病毒重組插入容量有限（10kb） |
| 腺相關(guān)病毒 | 基因組小（5kb） 可特異整合于人19號(hào)染色體 以人細(xì)胞作為宿主 無(wú)毒、無(wú)致病性 | 尚未研究清楚 需腺病毒輔助復(fù)制 攜帶外源基因能力有限（4kb） 難得到高滴度病毒 |
| 腺病毒 | 適于原位使用，尤其是肺 (在不分裂細(xì)胞中可進(jìn)行高效率的體內(nèi)感染) 病毒滴度高（1010pfu/ml） 生物學(xué)特性清楚 | 不與宿主基因組整合(只有短暫表達(dá)) 載本基因組復(fù)雜 病毒蛋白可能引起免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng) 插入外源基因能力有限（7-8kb） |
| 脂質(zhì)體 | 無(wú)感染能力 理論上無(wú)DNA大小限制 毒性低 | 無(wú)特異性靶細(xì)胞 轉(zhuǎn)染效率低 僅有短暫表達(dá) 體內(nèi)應(yīng)用困難 |
| 受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn) | 無(wú)感染能力 特異性轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞 理論上無(wú)DNA大小限制 構(gòu)建靈活 | 轉(zhuǎn)染效率低 體內(nèi)應(yīng)用困難 可能有免疫原性 只有短暫表達(dá) |
（三）靶細(xì)胞的選擇
理論上講，無(wú)論何種細(xì)胞均具有接受外源DNA的能力，目前基因治療中禁止使用生殖細(xì)胞作為靶細(xì)胞，而只能使用體細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)基因的體細(xì)胞必須取材方便，含量豐富，容易培養(yǎng)，壽命較長(zhǎng)。可選擇的細(xì)胞有淋巴細(xì)胞、造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等。在實(shí)際上應(yīng)用中應(yīng)具體根據(jù)目的條件選擇。
（四）細(xì)胞轉(zhuǎn)染（tansfection）
將目的基因?qū)氚屑?xì)胞的方法很多，大致可分為物理學(xué)方法、化學(xué)方法、融合法和病毒感染法四類(lèi)。病毒法已在本節(jié)的“基因的轉(zhuǎn)運(yùn)”中有基因介紹。目前較多使用的是脂質(zhì)體法。
表23-3 DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞常見(jiàn)的方法
| 名稱 | 機(jī)制 | 轉(zhuǎn)染效率 | 用途 | 優(yōu)缺點(diǎn) | 影響因素 |
| 磷酸鈣轉(zhuǎn)染法 | 內(nèi)吞作用 | 20%細(xì)胞被轉(zhuǎn)染 | 瞬時(shí)表達(dá) | 1、簡(jiǎn)單有效 2、適用于貼壁、非貼壁細(xì)胞 3、常作首選方法 | 1、Ca2+，DNA濃度 2、PH值，沉淀反應(yīng)時(shí)間 3、氯喹，甘油和丁酸鈉處理 |
| DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法 | 抑制核酸酶 內(nèi)吞作用 | 在BDC-1，CV-1和COS細(xì)胞中較高 | 瞬時(shí)表達(dá) | 操作簡(jiǎn)單 | 1、需高濃度DNa 2、DEAE葡聚糖濃度 3、溫育時(shí)間 |
| Poly-brene轉(zhuǎn)染法 | 不清楚 | 低分子量DNA轉(zhuǎn)染率高于磷酸鈣法 | CHO細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子 | 能得到較多的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子 | 1、受體細(xì)胞類(lèi)型 2、轉(zhuǎn)染調(diào)控信號(hào) 3、DNA濃度 |
| 原生質(zhì)體融合 | 胞膜融合 | 50-100%轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定子得率為0.2-0.02% | 瞬時(shí)表達(dá) 穩(wěn)定表達(dá) | 1、操作復(fù)雜 2、不能進(jìn)行共轉(zhuǎn)染 3、慎用于篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型變異株 | 1、溶菌酶、PEG濃度 2、溫育時(shí)間 |
| 電穿孔 | 高壓在膜上形成微孔 | 效率較高 | 瞬時(shí)表達(dá) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化 | 1、需精密儀器 2、可用于動(dòng)物、植物細(xì)胞和細(xì)菌 | 1、電場(chǎng)強(qiáng)度 2、脈沖長(zhǎng)度 3、溫度，DNA濃度 4、培養(yǎng)液 |
| 脂質(zhì)體 | 脂膜融合 | 50-60%轉(zhuǎn)染 | 瞬時(shí)表達(dá) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化 | 1、操作簡(jiǎn)單 2、可用于體內(nèi)試驗(yàn) | 1、脂質(zhì)體質(zhì)量 2、DNA濃度 |
| 胞核微注射法 | 直接注射 | 50-100%轉(zhuǎn)染 | 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化 | 1、需要特殊儀器 2、處理樣品數(shù)量少 3、高效 | 1、注射技術(shù) 2、DNA濃度 |
在目前的技術(shù)狀態(tài)下，一般而言其基因轉(zhuǎn)染效率很難達(dá)到100%。故必須首先將轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和未轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞加以區(qū)分。這方面的新技術(shù)發(fā)展很快，常用的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞篩選方法有：
利用基因表達(dá)產(chǎn)物篩選法：
（1）標(biāo)記基因篩選法：在載體上引入一個(gè)標(biāo)記基因，或同時(shí)導(dǎo)入標(biāo)記基因，在轉(zhuǎn)染后的適當(dāng)時(shí)間選用合適劑量的選擇培養(yǎng)基，篩選標(biāo)記基因表型，那些已導(dǎo)入外源基因的細(xì)胞將存活下來(lái)，而未轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞則死于選擇性 細(xì)胞培養(yǎng) 基。如在較多的載體中都有neor標(biāo)記基因存在，若向培養(yǎng)基中加入G418進(jìn)行選擇，最后只有轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞存活下來(lái)。
（2）基因缺陷型受體細(xì)胞的選擇性：以基因缺陷型細(xì)胞作為靶細(xì)胞，將正常基因?qū)牖蛉毕菪桶屑?xì)胞后，使用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。例如將TK基因?qū)隩K-的靶細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄細(xì)胞可在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞則不能在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
（3）基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)：將目的基因表達(dá)載體DNA和標(biāo)記基因表達(dá)載體DNA混合后共同轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中，分別使用標(biāo)記基因和目的基因?qū)?yīng)的選擇劑進(jìn)行兩次篩選，最后得到復(fù)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)化子。
分子生物學(xué)方法：外源基因是否真的轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞必須用分子雜交方法進(jìn)行證實(shí)。常用的方法有原位雜效，Southern雜交和打點(diǎn)雜交。其中主要問(wèn)題是探針的選擇。若靶細(xì)胞內(nèi)原來(lái)不存在所轉(zhuǎn)入的目的基因，可選用目的基因作為探針；靶細(xì)胞內(nèi)一般無(wú)標(biāo)記基因存在，故標(biāo)記基因是良好的探針。探針大小可以是較大的DNA片段，亦可是人工合成的DNA單鏈探針?lè)肿印CR方法目前也已用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的鑒定，且該法相對(duì)簡(jiǎn)單易行。
（五）外源基因的表達(dá)及檢測(cè)
在篩選出轉(zhuǎn)化分子后還需要鑒定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中外源基因的表達(dá)狀況。其中包括對(duì)目的基因和標(biāo)記基因表達(dá)的鑒定。常用方法有原位雜交，Northrn雜交，NRA打點(diǎn)雜交，免疫組織化學(xué)染色等，前幾項(xiàng)是檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA，后者則是檢測(cè)外源基因翻譯出的蛋白質(zhì)。流式細(xì)胞儀是一種較為客觀準(zhǔn)確的儀器，可定量分析外源基因的表達(dá)狀況。
一些影響基因表達(dá)的因素如表4所示。
表23-4 調(diào)節(jié)重組細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的DNA控制元件
| 啟動(dòng)子 病毒啟動(dòng)子：如LTRS，CMV，SV40啟動(dòng)子在短時(shí)間后易于關(guān)閉，尤其是在逆轉(zhuǎn)錄病毒中 看家基因啟動(dòng)子：如二氫葉酸還原啟動(dòng)子可長(zhǎng)期表達(dá)轉(zhuǎn)基因，但水平很低。 組織/細(xì)胞特異性啟動(dòng)子：一些編碼含量豐富蛋白的基因的啟動(dòng)子如肌肉中肌酸激酶的啟動(dòng)子能夠進(jìn)行特異性強(qiáng)表達(dá) 可誘導(dǎo)啟動(dòng)子：如金屬硫蛋白基因的啟動(dòng)子，類(lèi)固醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可調(diào)節(jié)基因表達(dá) |
| 其它調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的順式作用調(diào)節(jié)元件 增強(qiáng)子，位點(diǎn)控制元件，內(nèi)含子序列及編碼序列本身可影響基因表達(dá)調(diào)節(jié)。 |
| 影響轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的序列 3’-mRNA序列：對(duì)于穩(wěn)定mRNA及進(jìn)行翻譯可能是必需的。 |
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