溫度對酶活力的影響——最適溫度的測定
[原理]
溫度對酶的影響具有雙重作用。
一方面，溫度加速酶反應的速度；
另一方面酶是蛋白質，溫度升高會加速酶蛋白的變性。
因此，在較低溫度范圍內，酶反應速度隨溫度升高而增大；超過一定溫度后，反應速度下降。
酶反應速度達到最大值時的溫度稱酶反應的最適溫度。
如果保持其它反應條件恒定，而在一系列變化的溫度下測酶活力；以溫度為橫坐標，反應速度為縱坐標作圖，可得到一條溫度-酶活力曲線，從中可求得最適溫度。
各種酶的最適溫度是不同的，一般動物組織的各種酶的最適溫度在35～40℃，植物和微生物的各種酶的最適溫度范圍較大，大約在32～60℃之間。
但最適溫度不是酶的特征常數，一種酶的最適溫度不是一個恒定數值，它與反應條件有關。
如反應時間延長，一般最適溫度降低。因此，對同一種酶來講，應說明是在什么條件下的最適溫度。
溫度是影響酶促反應速度的重要因素之一。
在溫度較低時，絕對溫度對Vmax的影響遵守Arrnenius公式程式： 式中 Ea——酶促反應的活化能（J?mol －1 ）；
R——氣體常數（8.314J?mol －1 ?K －1 ）；
T——絕對溫度（K）；
Vmax——當酶全部被過量底物飽和時所測得的反應速度。
實驗時，測定不同溫度下的酶促最大反應速度Vmax，以log 10 Vmax對絕對溫度T作圖，得一斜率等于-Ea/ 2.3R的直線，由此可求得活化能Ea。
[方法和步驟]
取8支試管0～7編號，0號為空白。各管加入0.5mL 5mmol/L磷酸苯二鈉溶液（pH5.6）。
將1至7號管依次相對應地置于20℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃和70℃的恒溫水浴中，預熱2分鐘。
然后各管計時加入稀釋好的酶液0.5mL，充分搖勻，精確反應15min后，加入1mol/L碳酸鈉溶液2mL，再加入0.5mL Folin-酚稀溶液，繼續保溫顯色10min。
空白管所加 試劑 相同，但酶液最后加入。
取出冷卻后，以0號管作空白，置分光光度計中在波長680nm處讀取各管的吸光度A 680 值。
整個操作過程如下：
管號 試劑 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 0* |
反應溫度/℃ | 20 | 30 | 35 | 40 | 50 | 60 | 70 | 50 |
5mmol/L磷酸苯二鈉 | 各0.5 mL | |||||||
稀釋酶液（35℃預熱） | 各0.5 mL | |||||||
分別在不同溫度下精確反應15min | ||||||||
1mol/L碳酸鈉溶液 | 各2.0 mL | |||||||
Folin-酚溶液 | 各0.5 mL | |||||||
35℃保溫顯色10min | ||||||||
A 680 | ||||||||
注：0號管在50℃反應，酶液最后加入。
[數據處理]
1、以反應溫度為橫坐標，A 680 (代表反應速度)為縱坐標，繪制溫度～酶活力曲線，求出酸性磷酸 酯酶 在本實驗條件下的最適溫度。
2、以反應絕對溫度的倒數（1/T）為橫坐標，log 10 A 405 為縱坐標作圖，求出直線部分的斜率，計算酶促反應的活化能。
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