聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)實驗
【實驗目的】
學習和掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的工作原理和操作技術。
【實驗原理】
聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacryamide gel electropHoresis, PAGE)是由丙烯酰胺單體和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺在催化作用下形成的三維網狀結構物質。在不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳中，凝膠的制作是分層進行的，因此凝膠不僅有分子篩效應，還具有濃縮效應。
和瓊脂糖凝膠相比，聚丙烯酰胺凝膠難于制備和處理。
它們的分離范圍較窄。但是它們也有突出的優點，由于是不連續的pH 梯度，故樣品被壓縮成一條狹窄的區帶，因而增強了分離效果，提高電泳分辨率。
尤其對小DNA 片段的分析(5～500bp)。
在這一范圍內，僅差1bp 的DNA 分子也能清晰地分開。
其次，DNA 純度很高。從聚丙烯酰胺凝膠中得到的DNA 純度很高以致于下步操作不用任何處理。
還有，它的負載容量高。該膠的標準加樣槽中可以加入高達10mL 的DNA 樣品，而不影響電泳分辨率。
多應用于分離純化和鑒定大小為5～500bp 的DNA 片段。聚丙烯酰胺凝膠電泳有連續與不連續體系兩種，前者指在整個電泳體系中的緩沖液pH 值和凝膠孔徑大小相同，主要用于核酸分析。
后者主要用于蛋白質樣品的分離，它除了電泳槽中的緩沖體系和pH 值與凝膠中不同外，凝膠本身也由緩沖體系、pH 值和凝膠孔徑不同的兩種凝膠堆積而成。以下主要介紹連續體系。
【 儀器 、材料與試劑 】
1.30%的丙烯酰胺/N,N＇—甲基雙丙烯酰胺(Acr/Bis)：29g 的丙烯酰胺，1g 的N,N＇—甲基雙丙烯酰胺，加蒸餾水至100mL。
2.10%過硫酸銨(Aps)：0.4g 過硫酸銨，4mL 蒸餾水，TEMED(N,N,N＇,N＇—四甲基乙二胺)。
3.1.5mol/L Tris-HCI(pH8.8)：量取3mol/L Tris 母液50mL，用鹽酸調節pH 至8.8，用重蒸水定容至100mL(4℃存放)；0.5mol/L Tris-HCI(pH6.8)：量取1mol/L Tris 溶液50mL，用鹽酸調節pH 至6.8，用重蒸水定容至100mL(4℃存放)。
4.10%十二烷基硫酸鈉(SDS)(室溫存放)。
5.1×TBE 緩沖液：89mol/LTris-硼酸鹽，2mol/L EDTA(pH8.0)。
6.I 型加樣緩沖液：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，40%蔗糖水溶液(W/V) 4℃貯存。封底膠：1%瓊脂糖溶液(用蒸餾水配置)。
7.染色液：0.2g 考馬斯亮藍R-250、84mL95%乙醇、20mL 冰醋酸，定容至200mL，過濾備用。
8.脫色液：醫用酒精:冰醋酸:水=4.5:0.5:5(V:V:V)。
9.保存液：7%冰醋酸。
10.玻璃板、隔片、電泳槽、燒杯、磁力攪拌棒、微波爐或加熱器、天平、梳子、紫外分析儀、電源等。
【實驗步驟】
連續體系
1.制備100mL 凝膠液；
蒸餾水 37.5mL
微波爐加熱30s，攪拌棒攪拌
尿素 50g
10×TBE 緩沖液 8mL
30%丙烯酰胺 10mL
倒膠之前
10%過硫酸銨 0.8mL
TEMED 23.5μL
2.用去污劑清洗一長一短兩塊玻璃板以及插入兩板間的間隔片，然后用乙醇擦干。
3.將長短兩板一邊對齊，插入大約1.5cm 寬的間隔片，用夾子將玻璃板三面夾緊。用封底膠(1%瓊脂糖溶液)將膠板的三面封好。
4.加10%過硫酸銨和TEMED 于膠溶液中混勻，立即灌膠。為了避免產生氣泡，灌膠時應小心緩慢。如有氣泡產生，用橡皮錘或鉛筆頭從下至上輕敲膠板將氣泡趕出。
5.加至距短玻璃板上緣約0.5cm 時，停止加膠。輕輕插入大小合適的梳子，此時不要讓梳子下面產生氣泡，夾緊梳子和膠板，再把剩下的膠液加到梳子兩側。
6.室溫凝聚時間約為0.5～1h。
7.小心移去梳子，用水清洗加樣孔，把膠固定于電泳槽上，加入1×TBE 緩沖液。
8.取DNA 樣品和6 倍I 型加樣緩沖液混勻。每孔加3～5/μL 該混合液。電泳時電壓梯度為1V/cm 到8V/cm。
9.電泳完畢后，取出膠并將其放在EB 中染色30min。EB 濃度為(0.5μg/mL 1 倍的TBE 緩沖液)。
10.紫外光下分析、拍照。
(不連續體系主要是用于分析蛋白質，過程可見第三章，故在此不于介紹。)
【注意事項】
1.制備凝膠應選用高純度 試劑 ，否則影響凝膠凝固和電泳效果。Acr 和Bis 均為神經毒劑，對皮膚有刺激作用，操作時應帶手套和口罩，純化應在通風櫥中進行。
2.勿用手接觸灌膠面的玻璃，以防凝膠板和玻璃板剝離，產生氣泡和滑膠，或者剝膠時凝膠板易斷裂。故所用器材均應嚴格清洗。
3.用瓊脂糖封底及灌膠時不能有氣泡，以免影響電泳時電流的通過。
4.為防止電泳后區帶拖尾，樣品中鹽離子強度應盡量降低。含鹽量高的樣品可用透析法或凝膠過濾法脫鹽。
5.凝膠完全凝固后，必須放置30min 左右，使其充分“老化”后，才能輕輕取出樣品梳，切勿破壞加樣孔底部的平整，以免電泳后區帶扭曲。
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