堿性蛋白酶活力的測定（福林—酚試劑法）
一、實驗目的
①學習測定蛋白酶活力的方法。
②掌握分光光度計 的原理和使用方法。
③學習繪制標淮曲線的方法。
二、實驗原理
福林—酚試劑是磷鉑酸鹽與磷鎢酸鹽的混合物。
它在堿性條件下不穩定，能被酪氨酸中的酚基還原，生成鉑藍、鎢藍的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后產生的酪氨酸可與福林—酚試劑反應，所生成的藍色化合物可用比色法測定。
三、實驗器材
①分光光度計
②恒溫水浴鍋
②冷凝器
四、材料與試劑
①市售的堿性蛋白酶制劑。
②0.4mo/L碳酸鈉：42.4gNa2CO3用蒸餾水溶解.定容到l000mL。
③4mo1/L三氯醋酸：65.6g三氯醋酸用蒸餾水溶解，定容到1000 mL。
④2%酪蛋白：2.0g酪蛋白加40mL蒸餾水，加3—5滴濃氨水，于沸水浴上溶解。
用pH11的硼酸鈉-氫氧化鈉緩沖溶液定容到1000mL。
⑤pH11的硼酸鈉-氫氧化鈉緩沖溶液：0.1mol/LNaOH與0.05mol/LNa2B4O7等體積混合。
⑥福林—酚試劑：50g鎢酸鈉(Na2W04·2H20)，12.5g鉑酸鈉(Na2Mo04·2H20)，
350mL水，25mL 85%磷酸，50mL濃鹽酸放入1000mL圓底燒瓶中，文火回流(保持微沸)10 h，撤下冷凝器，加150g硫酸鏗(Li2O4)，25mL水，混勻加溴水約5mL脫色。
直至金黃色為止，再微沸15min，驅除殘溴，冷卻，用4—5號耐酸細菌 漏斗過濾，定容到500mL，盛于洗干凈干燥的棕色瓶中，使用時以1：2稀釋。
五、操作方法
(1)樣品處理
精確稱取粉制酶制劑1.0g用PH 11的硼酸鈉—氫氧化鈉緩沖液溶解并定容到200ml,于40℃浸取30min，濾紙過濾，取2ml濾液用PH11的硼酸鈉-氫氧化納緩沖液定容到50mL。
(2)比色測定
取10mL離心管4支分別加入稀釋筋液1.0mL。
平行試驗3支 空白試驗1支
①于40℃水浴預熱2—3min。 ①于40℃水浴預熱2—3min。
②加1.0mL 40℃預熱的2%酪蛋 ②加2.0mL 0.4mol/L三氯醋酸40℃保
白，于40℃反應10min。 溫10min。
③加2.OmL 0.4mol/L三氯醋酸反 ③加l.0mL 2%的酪蛋白，反應15min
應15min過濾。 過濾。
④取過濾液1.0mL放入盛有5mL Na2C03溶液的試管中。
⑤加1.0mL l：2稀釋的福林—酚試劑(此試劑應最后加入)于40℃水浴發色20 min。
⑥7220型分光光度計在680nm比色，比色皿厚1cm。
(3)比色常數(K)的求法
| 編號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 酪氨酸/ml | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 |
| H2 O/ml | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 |
| Na2 CO3 /ml | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 福林-酚/ml | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| OD680 |
將DL-酪氨酸于105℃烘2h，精確稱取0.1000g，加少量0.2mol/L鹽酸加熱溶解，用蒸餾水定容到1000mL(每毫升含DL-酪氨酸100.0 μg)，取5支試管，按下表加樣。
搖勻于40℃發色20min，以0號管為空白，在680nm進行比色。
以吸光度OD為縱坐標，以DL-酪氨酸含量(μg)為橫坐標作一直線，可求出比色常數K—單位吸光度值相當DL-酪氨酸的μg數。
(4)計算
活力單位規定：在pH11，40℃，1min內產生1mg酪氨酸的酶量(g)為一個活力單位。
總活力(U/g)=K× ×OD×稀釋倍數
式中 K—為比色常數，DL—酪氨酸μg/吸光度;
OD——吸光度;
稀釋倍數——200′ 50/2;
4——酶活測定液的稀釋倍數;
10——酶促反應時間，min。
北京天優福康生物科技有限公司
服務熱線：400-860-6160
聯系電話/微信：13718308763
QQ:2136615612 3317607072
E-mail：Tianyoubzwz@163.com
