總氮量的測定——凱氏定氮法
[原理]
凱氏定氮法是分析有機(jī)化合物含氮量的常用方法。要測定有機(jī)物含氮量，通常是設(shè)法使其轉(zhuǎn)變成無機(jī)氮，再進(jìn)行測定。
凱氏定氮法首先將含氮有機(jī)物與濃硫酸共熱，經(jīng)一系列的分解、碳化和氧化還原反應(yīng)等復(fù)雜過程，最后有機(jī)氮轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)氮硫酸銨，這一過程稱為有機(jī)物的消化。
為了加速和完全有機(jī)物質(zhì)的分解，縮短消化時間，在消化時通常加入硫酸鉀、硫酸銅、氧化汞、過氧化氫等試劑，加入硫酸鉀可以提高消化液的沸點(diǎn)而加快有機(jī)物分解，除硫酸鉀外，也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等鹽類類提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。硫酸銅起催化劑的作用。
凱氏定氮法中可用的催化劑種類很多，除硫酸銅外，還有氧化汞、汞、硒粉、鉬酸鈉等，但考慮到效果、價格及環(huán)境污染等多種因素，應(yīng)用最廣泛的是硫酸銅。
使用時常加入少量過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機(jī)物氧化。
消化完成后，將消化液轉(zhuǎn)入凱氏定氮儀反應(yīng)室，加入過量的濃氫氧化鈉，將NH 4 + 轉(zhuǎn)變成NH 3 ，通過蒸餾把NH 3 驅(qū)入過量的硼酸溶液接受瓶內(nèi)，硼酸接受氨后，形成四硼酸銨，然后用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復(fù)原來的氫離子濃度。
滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸摩爾數(shù)即為NH 3 的摩爾數(shù)，通過計算即可得出總氮量。
在滴定過程中，滴定終點(diǎn)采用甲基紅-次甲基藍(lán)混合指示劑顏色變化來判定。
測定出的含氮量是樣品的總氮量，其中包括有機(jī)氮和無機(jī)氮。
以蛋白質(zhì)為例，反應(yīng)式如下：
消化：蛋白質(zhì) + H 2 SO 4 →（NH 4 ） 2 SO 4 + SO 2 ↑+ CO 2 ↑+ H 2 O
蒸餾：（NH 4 ） 2 SO 4 + 2NaOH→ Na 2 SO 4 + 2 H 2 O + 2NH 3 ↑
2NH 3 + 4H 3 BO 3 →（NH 4 ） 2 B 4 O 7 + 5H 2 O
滴定：（NH 4 ） 2 B 4 O 7 + 2HCl + 5H 2 O→2NH 4 Cl + 4 H 3 BO 3
蛋白質(zhì)是一類復(fù)雜的含氮化合物，每種蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量[約在14％~18％，平均為16％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）]。
凱氏定氮法測定出的含氮量，再乘以系數(shù)6.25，即為蛋白質(zhì)含量。
本法適用于測定0.2～1.0mg氮的樣品測定。
通過本實(shí)驗使學(xué)生能理解凱氏定氮法的原理，掌握凱氏定氮法的操作方法。
[方法和步驟]
（一）消化
1、準(zhǔn)備6個凱氏燒瓶，標(biāo)號。1、2、3號燒瓶中分別加入適當(dāng)濃度的蛋白溶液1.0mL，樣品要加到燒瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶頸上。
再依次加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑0.3g，濃硫酸2.0mL，30%過氧化氫1.0mL。
4、5、6號燒瓶作為空白對照，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質(zhì)，對樣品測定進(jìn)行校正。
4、5、6號燒瓶中加入蒸餾水1.0mL代替樣液，其余所加試劑與1、2、3號燒瓶相同。
2、將加好試劑的各燒瓶放置消化架上，接好抽氣裝置。
先用微火加熱煮沸，此時燒瓶內(nèi)物質(zhì)炭化變黑，并產(chǎn)生大量泡沫，務(wù)必注意防止氣泡沖出管口。
待泡沫消失停止產(chǎn)生后，加大火力，保持瓶內(nèi)液體微沸，至溶液澄清后，再繼續(xù)加熱使消化液微沸15min。
在消化過程中要隨時轉(zhuǎn)動燒瓶，以使內(nèi)壁粘著物質(zhì)均能流入底部，以保證樣品完全消化。消化時放出的氣體內(nèi)含SO 2 ，具有強(qiáng)烈刺激性，因此自始自終應(yīng)打開抽水泵將氣體抽入自來水排出。
整個消化過程均應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。消化完全后，關(guān)閉火焰，使燒瓶冷卻至室溫。
（二）蒸餾和吸收
蒸餾和吸收是在微量凱氏定氮儀內(nèi)進(jìn)行的。凱氏定氮蒸餾裝置種類甚多，大體上都由蒸氣發(fā)生、氨的蒸餾和氨的吸收三部分組成。
1、 儀器 的洗滌
儀器 安裝前，各部件需經(jīng)一般方法洗滌干凈，所用橡皮管、塞須浸在10%NaOH溶液中，煮約10min，水洗、水煮10min，再水洗數(shù)次，然后安裝并固定在一只鐵架臺上。
儀器使用前，微量全部管道都須經(jīng)水蒸氣洗滌，以除去管道內(nèi)可能殘留的氨，正在使用的儀器，每次測樣前，蒸氣洗滌5min即可。較長時間未使用的儀器，重復(fù)蒸氣洗滌，不得少于三次，并檢查儀器是否正常。仔細(xì)檢查各個連接處，保證不漏氣。
首先在蒸氣發(fā)生器中加約2/3體積 蒸餾 水，加入數(shù)滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影響結(jié)果，并放入少許沸石（或毛細(xì)管等），以防爆沸。
沿小玻杯壁加入 蒸餾 水約20mL讓水經(jīng)插管流入反應(yīng)室，但玻杯內(nèi)的水不要放光，塞上棒狀玻塞，保持水封，防止漏氣。
蒸氣發(fā)生后，立即關(guān)閉廢液排放管上的開關(guān)，使蒸氣只能進(jìn)入反應(yīng)室，導(dǎo)致反應(yīng)室內(nèi)的水迅速沸騰，蒸出蒸氣由反應(yīng)室上端口通過定氮球進(jìn)入冷凝管冷卻，在冷凝管下端放置一個錐形瓶接收冷凝水。
從定氮球發(fā)燙開始計時，連續(xù)蒸煮5min，然后移開煤氣燈。
沖洗完畢，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器之間的連接橡膠管，由于氣體冷卻壓力降低，反應(yīng)室內(nèi)廢液自動抽到反應(yīng)室外殼中，打開廢液排出口夾子放出廢液。
如此清洗2～3次，再在冷凝管下?lián)Q放一個盛有硼酸-指示劑混合液的錐形瓶使冷凝管下口完全浸沒在溶液中，蒸餾1～2min，觀察錐形瓶內(nèi)的溶液是否變色。
如不變色，表示蒸餾裝置內(nèi)部已洗干凈。
移去錐形瓶，再蒸餾1～2min，用蒸餾水沖洗冷凝器下口，關(guān)閉煤氣燈，儀器即可供測樣品使用。
2、無機(jī)氮標(biāo)準(zhǔn)樣品的蒸餾吸收
由于定氮操作繁瑣，為了熟悉蒸餾和滴定的操作技術(shù)，初學(xué)者宜先用無機(jī)氮標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行反復(fù)練習(xí)，再進(jìn)行有機(jī)氮未知樣品的測定。
常用巳知濃度的標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨測試三次。
取潔凈的100mL錐形瓶五只，依次加入2%硼酸溶液20mL，次甲基藍(lán)-甲基紅混合指示劑（呈紫紅色）3～4滴，蓋好瓶口待用。取其中一只錐形瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸沒在溶液中。
注意：在此操作之前必須先打開收集器活塞，以免錐形瓶內(nèi)液體倒吸。
準(zhǔn)確吸取2mL硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)液加到玻杯中，小心提起棒狀玻塞使硫酸銨溶液慢慢流入蒸餾瓶中，用少量蒸餾水沖洗小玻杯3次，一并放人蒸餾瓶中。
然后用量筒向小玻杯中加入10 mL 30％NaOH溶液，使堿液慢慢流入蒸餾瓶中，在堿液尚未完全流入時，將棒狀玻塞蓋緊。
向小玻杯中加約5mL蒸餾水，再慢慢打開玻塞，使一半水流入蒸餾瓶，一半留在小玻杯中作水封。關(guān)閉收集器活塞，加熱蒸氣發(fā)生器，進(jìn)行蒸餾。
錐形瓶中的硼酸-指示劑混合液由于吸收了氨，由紫紅色變成綠色。自變色時起，再蒸餾3～5min，移動錐形瓶使瓶內(nèi)液面離開冷凝管下口約lcm，并用少量蒸餾水沖洗冷凝管下口，再繼續(xù)蒸餾1min，移開錐形瓶，蓋好，準(zhǔn)備滴定。
在一次蒸餾完畢后，移去煤氣燈，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器間的橡膠管，排除反應(yīng)完畢的廢液，用水沖洗小玻杯幾次，并將廢液排除。
如此反復(fù)沖洗干凈后，即可進(jìn)行下一個樣品的蒸餾。
按以上方法用標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨再做兩次。另取2mL蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨進(jìn)行空白測定二次。
將各次蒸餾的錐形瓶一起滴定。
3、未知樣品及空白的蒸餾吸收
將消化好的蛋白樣品三支，空白對照液三支，依次作蒸餾吸收。
加5mL熱的蒸餾水至消化好的樣品或空白對照液中，通過小玻杯加到反應(yīng)室中，再用熱蒸餾水洗滌小玻杯3次，每次用水量約3mL，洗滌液一并倒入反應(yīng)室內(nèi)。其余操作按標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨的蒸餾進(jìn)行。
由于消化液內(nèi)硫酸鉀濃度高而呈粘稠狀，不易從凱氏燒瓶內(nèi)倒出，必須加入熱蒸餾水5 mL稀釋之，如果有結(jié)晶析出，必須微熱溶解，趁熱加入玻杯，使其流入反應(yīng)室。
此外，還應(yīng)當(dāng)注意趁儀器洗滌尚未完全冷卻時立即加入樣品或空白對照液，否則消化液通過冷卻的管道容易析出結(jié)晶，造成堵塞。
（三）滴定
樣品和空白蒸餾完畢后，一起進(jìn)行滴定。
打開接受瓶蓋，用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行滴定。
待滴至瓶內(nèi)溶液呈暗灰色時，用蒸餾水將錐形瓶內(nèi)壁四周淋洗一次。若振搖后復(fù)現(xiàn)綠色，應(yīng)再小心滴入標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液半滴，振搖觀察瓶內(nèi)溶液顏色變化，暗灰色在一二分鐘內(nèi)不變，當(dāng)視為到達(dá)滴定終點(diǎn)。
若呈粉紅色，表明已超越滴定終點(diǎn)，可在已滴定耗用的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液用量中減去0.02mL，每組樣品的定氮終點(diǎn)顏色必須完全一致。
空白對照液接受瓶內(nèi)的溶液顏色不變或略有變化尚未出現(xiàn)綠色，可以不滴定。記錄每次滴定耗用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液毫升數(shù)，供計算用。
[結(jié)果與計算]
運(yùn)算下列公式計算出每次無機(jī)氮標(biāo)準(zhǔn)樣品和未知樣品的總含氮量。
式中 W N ——每毫升樣品的含氮毫克數(shù)；
A——滴定樣品消耗的鹽酸量（mL）；
B——滴定空白消耗的鹽酸量（mL）；
C——測定樣品所取用量（mL）；
0.0100——標(biāo)準(zhǔn)鹽酸物質(zhì)的量濃度（mol/L）；
14.008——每摩爾氮原子質(zhì)量（g/mol）。
三次樣品測定的含氮量相對誤差應(yīng)小于±2%。
樣品粗蛋白含量＝總氮量× 6.25
6.25為含氮量換算為蛋白質(zhì)含量的系數(shù)。.這個系數(shù)來自蛋白質(zhì)平均含氮量為16％，實(shí)際上各種蛋白質(zhì)因 氨基酸 組成不同，含氮量不完全相同。
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