聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質(zhì)
【原理】
聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)普遍運(yùn)用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸。
其基本方式有兩種：圓盤電泳(disc-electrophoresis)和平板電泳(slab-electrophoresis)。
不論圓盤電泳或平板電泳都有連續(xù)和不連續(xù)電泳之分。
電泳在電極緩沖液、凝膠緩沖液、凝膠孔徑一致的體系中進(jìn)行，稱為連續(xù)PAGE；電泳在電極緩沖液、凝膠緩沖液pH不同、凝膠孔徑不同的體系中進(jìn)行，稱為不連續(xù)PAGE。
不連續(xù)PAGE分離中包括三種物理效應(yīng)：樣品的濃縮效應(yīng)、電泳分離的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。
而連續(xù)PAGE則不具備濃縮效應(yīng)。
本實(shí)驗(yàn)介紹不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳。
【試劑及器材】
1．分離膠緩沖液(pH8.9) 稱取Tris 36.3g，lmol／L HCl溶液48ml，加蒸餾水80ml使其溶解，pH調(diào)至8.9，用蒸餾水定容至100ml，置棕色瓶中，4℃冰箱保存。
2．濃縮膠緩沖液(pH6.7) 稱取Tris 5.98g，lmol／LHCl溶液48ml，加蒸餾水至80ml使其溶解，pH調(diào)至6.7，用蒸餾水定容至100ml，置棕色瓶中，4℃冰箱保存。
3．凝膠貯備液(30％單體交聯(lián)劑) 稱取丙烯酰胺(Acr)29.2g，甲叉雙丙烯酰胺(Bis)0.8g，加蒸餾水溶解后定容至100ml，過濾，將未溶物濾去，盛于棕色瓶中， 4℃冰箱保存，可使用1個月。
4．電極緩沖液(pH8.3) 稱取甘氨酸28.8g，Tris 6.0g，加蒸餾水至850ml，調(diào)pH至&3，用蒸餾水定容至1000ml，4℃冰箱保存，用時可作10倍稀釋。
5．催化劑(10％過硫酸銨) 稱取過硫酸銨0.5g，加蒸餾水5ml。臨用前配制，4℃冰箱存放，最長不超過1周。
6．加速劑(四甲基乙二胺，TEMED) 原包裝液，存于4℃冰箱備用。
7．染色液 稱取考馬斯亮藍(lán)R—250(CBBR—250)L 25g，加入50％甲醇454ml溶解，再加入冰醋酸46ml，混勻。
8．固定液 12.5％三氯醋酸(TCA)
9．洗脫液 取冰醋酸30ml，甲醇125ml，用蒸餾水定容至500ml。
10．保存液 7％冰醋酸。
11．0.05％溴酚藍(lán)
12．電泳儀 選用電子管或晶體管整流電源。電壓0—600V，電流0—300mA。
13．電泳槽 圓柱型垂直電泳槽。
14．凝膠玻管 0.5～0.6cm×10cm。
15．小燒杯，50ul微量進(jìn)樣器，10cm長針頭或腰椎穿刺針頭，5或10ml注射器。
【操作步驟】
1．制備凝膠柱
(1) 取已準(zhǔn)備好的0.6cm×10cm玻管，從一端量至7cm和7.5cm兩處，用玻璃蠟筆劃線，插入橡皮墊后垂直置于小試管中。
(2) 配制分離膠：取一小燒杯，按表4-1加入各液，搖勻，此液總體積為10ml，凝膠濃度為7.5％。用5ml注射器、長針頭或用毛細(xì)滴管吸取分離膠液，沿管壁注入玻管至7cm劃線處，小心在凝膠液面上覆蓋一層蒸餾水(約0.5cm高)，盡量避免沖擊凝膠液面。待凝膠與水交界面可見一分界線后，傾去覆蓋的水并用濾紙條吸干。
試劑 分離膠溶液(ml) 濃縮膠溶液(ml) 分離膠緩沖液 1.25 - 濃縮膠緩沖液 - 1.25 單體交聯(lián)劑 2.5 1.0 蒸餾水 6.19 7.65 催化劑 0.05 0.05 加速劑 0.005 0.005
(3) 配制濃縮膠：按表4加入各液，搖勻。總體積為10ml，凝膠濃度為3.0％。按上法沿壁注入凝膠管至7.5cm處，再沿管壁加入蒸餾水(約0.5cm高)。待聚合后傾去并吸干蒸餾水，準(zhǔn)備加樣。
2．加樣 取血清0.1ml，40％蔗糖液0.1ml及0.05％溴酚藍(lán)0.1ml(作示蹤染料)于一小試管中混勻，用微量加樣器吸取10tq加到玻管濃縮膠表面，相當(dāng)于加血清3.3ul。
3．電泳
(1)將已加樣的凝膠管安裝在電泳槽上的橡皮孔中，使凝膠頂部恰好可見，并棄掉下端的橡皮墊。
(2)用毛細(xì)滴管吸電極緩沖液，小心注滿凝膠玻管(不能攪動樣品層)。然后將電極緩沖液慢慢倒人上、下電極槽中，上槽應(yīng)浸沒凝膠玻璃管，下槽液面應(yīng)超過凝膠玻管下端。小心排除凝膠管的上、下管口內(nèi)可能存在的氣泡，否則會影響導(dǎo)電。
(3)將上槽的電極接電泳儀的負(fù)極，下端接正極，通電。先調(diào)節(jié)電流為1毫安／管，待示蹤染料進(jìn)入分離膠后，再調(diào)節(jié)電流為2毫安／管。待示蹤染料達(dá)到玻管下口約0.5cm時，切斷電源，電泳完畢。
4．剝膠 取下凝膠管，用帶10cm長針頭的注射器吸滿蒸餾水。將針頭小心插入膠柱與管壁之間，一邊注水一邊旋轉(zhuǎn)玻管，靠水流壓力和潤滑力將玻管內(nèi)壁與凝膠分開，然后用洗耳球在膠管一端輕輕加壓，凝膠柱便緩緩從玻管中滑出。
5．固定、染色 將凝膠柱浸泡于12.5％的TCA中0.5～1h，然后轉(zhuǎn)入CBBR-250染色液中染色l～2h，或90℃水浴中染色10min。
6．脫色、保存 將已染色的凝膠柱置于7％冰醋酸溶液中浸洗，不斷更新冰醋酸，直到浸洗無色為止。全過程約需5—7d。或用洗脫液漂洗3～4次，每次20—30min。取lcm×l5cm小試管，內(nèi)盛7％冰醋酸溶液，把凝膠柱浸泡其中，加塞蠟封即可長期保存。
7．定量
(1)切片抽提法：切割特定區(qū)域的片段，用10倍量的水或0.1-0.2mol／L NaCl或適量的緩沖液進(jìn)行勻漿。4℃過夜抽提，離心取上清液，選擇合適的波長測定吸光度值。這種定量方法準(zhǔn)確性不高，可作為樣品的回收方法。
(2)微量光密度計(jì)法：目前已有不經(jīng)染色直接進(jìn)行紫外掃描的微量光密度計(jì)，也有必需經(jīng)過染色后進(jìn)行測定的光密度計(jì)，還有配備顯微裝置的超微量光密度計(jì)。為了消除圓柱狀凝膠的球面差，可將膠條放人7％冰醋酸內(nèi)進(jìn)行測定。
【注意事項(xiàng)】
1．Acr和Bis是神經(jīng)毒劑，可經(jīng)皮膚、呼吸道等吸收，操作時要注意保護(hù)。
2．Acr和Bis在低溫下穩(wěn)定，應(yīng)放棕色瓶干燥低溫(4℃)保存。30％單體交聯(lián)劑應(yīng)裝棕色瓶中，貯存于冰箱(4℃)能部分地防止水解，但也只能保存l～2月。可測定pH(4.9～5.2)來檢查是否失效，失效液不能聚合。
3．在制膠過程中用蒸餾水封住膠面是為了阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。
4．TEMED宜密封避光保存。
5．制備凝膠用玻管要用洗液浸泡清潔，如玻管不清潔，倒膠后在管壁會出現(xiàn)氣泡。
6．制備分離膠和濃縮膠時，加入催化劑和加速劑混合后約在10～30min內(nèi)聚合，故應(yīng)盡快注人玻管。如室溫過高，為防止過快聚合，可置冰浴中操作。如果凝膠不聚合，通常是由于制備的試劑濃度不準(zhǔn)確，或者凝膠混合液中漏加某一試劑，也可能是試劑不純所致。應(yīng)重新配制混合液。
7．本法可簡化，用同一分離膠以及同一緩沖液和pH的連續(xù)凝膠電泳，也可獲得較好的結(jié)果。
【評價(jià)】
聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠強(qiáng)度好，對熱穩(wěn)定，無電滲作用，透明度高，且凝膠孔徑大小可調(diào)節(jié)，所需樣品量小，并具有高分辨率等多種優(yōu)點(diǎn)。其中圓盤電泳設(shè)備簡單，操作方便。但平板電泳可用于同時對多個樣品的比較分析，而且結(jié)合十二烷基硫酸鈉(SDS)形成SDS—PAGE，或者與等電聚焦(IEF)配合作IEF-PAGE的雙向電泳，均可進(jìn)一步提高其分辨率及擴(kuò)大應(yīng)用范圍。
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