細胞表面抗原的流式檢測
細胞表面分子抗原的流式熒光檢測是最常用的細胞分析方法之一。美國 eBioscience 公司為小鼠、人和大鼠 CD 分子和其它膜分子提供了近乎完全的熒光標記抗體和純化抗體，成為實驗者研究工作的完美解決方案。
一、實驗材料
檢測管（如： Falcon Cat.No.2008 ）或 96 微孔板（ Falcon Cat.No.3910 ）
一抗（標記或純化）
Anti-CD16/32 抗體用于封閉 Fc 片段造成的非特異結合干擾（可選）
熒光二抗（間接標記染色）
緩沖液： eBioscience FC Staining Buffer （ Cat.No.00-4222 ）或 PBS （ PH7.4 ）
設備：移液器、離心機、冰盒或冰箱、流式細胞儀
二、注意事項
1. 抗體在使用之前迅速離心幾秒，使所有的液體都集中到管底。
2. 盡量避免直標抗體之間的聚集。
3. 抗體應避光 4 ℃ 保存，避免凍結。
4. 樣本的固定保存或較長時間放置可能會影響細胞表面分子和抗體之間的結合，故建議盡可能使用新鮮樣品.
三、操作方法
A ．小鼠淋巴組織細胞表面抗原的流式檢測步驟
（一） 樣品制備
1. 取出小鼠淋巴組織塊，迅速浸泡在 10ml 的 Staining Buffer 中，并用注射器的活塞研磨或使用兩塊預冷的載玻片研壓成單細胞。
2. 把懸液轉移到 50ml 的錐形管中靜置片刻，使細胞團塊和碎片沉降到管底，并通過尼龍網 ( 如 Falcon Cat. No. 2350) 過濾成單細胞懸液。
3. 4 ℃ 下300-400g離心4-5分鐘，棄去上清液。
4. 如果該樣品為脾臟細胞，加入一定量的RBC lysis裂解紅細胞，或者用分離液分離出淋巴細胞。若為其它樣品，略去此步驟。
5. 加入50ml staining Buffer 重懸細胞后計數，根據需要用 臺盼藍(Trypan Blue)進行細胞活性檢測。
6. 離心細胞液并棄去上清；用適量的 Staining Buffer 重懸細胞為 2 × 107 個 /ml 。若采用直接標記的一抗，則加入 CD16/32 抗體（ 0.5-1ug/106 細胞）冰上孵育 5-10 分鐘。
（二） 細胞熒光染色步驟
1. 在每個流式檢測管或板式微孔中加入 50ul 的稀釋后的一抗（抗體用 Staining Buffer 稀釋成合適的濃度）；在空白管 / 孔或同型對照管 / 孔中加入 50ul Staining Buffer 。若進行抗體最佳濃度測試，建議范圍 2-0.03ug/106 細胞。
2. 在各管 / 孔中分別加入 50ul 細胞懸液（約 106 細胞），并輕輕混勻。
3. 避光 冰浴或在4℃冰箱中孵育20分鐘。
（注：有些抗體可能需要更長的孵育時間，建議實驗者進行預試驗摸索）
4. 孵育完成后，加入 Staining Buffer （每流式檢測管中加 2ml ，而每微孔中加 200ul ）
5. 4 ℃ 下300-400g離心5分鐘，并棄去上清。
6. 重復洗滌過程3次。
7. 重懸細胞后上流式儀檢測。
a) 若使用的一抗是熒光直接標記抗體，用500ul Staining Buffer 重懸細胞后上機檢測。
b) 若使用的一抗是純化或生物素標記抗體，則每管/孔加入50-100ul稀釋好的熒光標記二抗或熒光標記親和素（用 Staining Buffer 稀釋成合適的濃度）后于 冰浴或在4℃冰箱中 避光 孵育15-30分鐘。洗滌細胞兩次（參考第4步和第5步方法）。之后500ul Staining Buffer 重懸細胞，并上機檢測。
8. 試驗結果分析。
（注：若要對多個細胞表面抗原進行多色標記，則同時加入熒光標記抗體后按以上操作步驟進行孵育和細胞洗滌；操作盡量保持在避光和 4 ℃ 左右的溫度下進行。）
B ．人外周血細胞表面抗原的流式檢測步驟
1. 在每個流式檢測管或板式微孔中加入 50ul 的熒光標記或生物素標稀釋后的一抗（抗體用 Staining Buffer 稀釋成合適的濃度）；在空白管 / 孔或同型對照管 / 孔中加入 50ul Staining Buffer 。（ eBioscience 公司 tests 規格抗體為即用型抗體，每個檢測管中加入 20ul 該類抗體）
2. 每管分別加入 100ul 全血，并輕輕混勻。
3. 室溫避光 孵育15-30分鐘。
（注：有些結合能力較低的抗體可能需要更長的孵育時間，建議實驗者進行預試驗摸索）
4. 每管分別加入 2ml RBC lysis Buffer （之前預熱恢復至室溫），混合均勻。
5. 室溫避光 孵育10分鐘，此孵育時間不要超過15分鐘。
6. 室溫 300-400g 離心5分鐘，并棄去上清。
7. 用2ml Staining Buffer 洗滌細胞一次。
8. 重懸細胞后上流式儀檢測。
a) 若使用的一抗是熒光直接標記抗體，用500ul Staining Buffer 或 2% 的多聚甲醛固定液重懸細胞后上機檢測。
b) 若使用的一抗是純化或生物素標記抗體，則每管/孔加入50-100ul稀釋好的熒光標記二抗或熒光標記親和素（用 Staining Buffer 稀釋成合適的濃度）后于 室溫 避光 孵育15-30分鐘。洗滌細胞1-2次（參考第7步方法）。之后500ul Staining Buffer 或 2% 的多聚甲醛固定液重懸細胞，并上機檢測。
9. 試驗結果分析。
（注：若要對多個細胞表面抗原進行多色標記，則同時加入熒光標記抗體后按以上操作步驟進行孵育和細胞洗滌；操作盡量保持在避光條件下進行。）
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