核酸的紫外吸收
嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵,使堿基、核苷、核苷酸和核酸在 240~290nm 的紫外波段有一強烈的吸收峰,因此核酸具有紫外吸收特性。
DNA 鈉鹽的紫外吸收在 260nm 附近有最大吸收值 ,其吸光率( absorbance )以 A260 表示, A260 是核酸的重要性質,在核酸的研究中很有用處。
在 230nm 處為吸收低谷, RNA 鈉鹽的吸收曲線與 DNA 無明顯區別。不同核苷酸有不同的吸收特性。
所以可以用紫外分光光度計加以定量及定性測定。
實驗室中最常用的是定量測定小量的 DNA 或 RNA 。
對待測樣品是否純品可用紫外分光光度計讀出 260nm 與 280nm 的 OD 值,因為蛋白質的最大吸收在 280nm 處,因此從 A260 /A280 的比值即可判斷樣品的純度。
純 DNA 的 A260 /A280 應為 1.8 ,純 RNA 應為 2.0 。
樣品中如含有雜蛋白及苯酚, A260 /A280 比值即明顯降低。
不純的樣品不能用紫外吸收法作定量測定。
對于純的核酸溶液,測定 A260 ,即可利用核酸的比吸光系數計算溶液中核酸的量,核酸的比吸光系數是指濃度為 1 μ g / mL 的核酸水溶液在 260nm 處的吸光率,天然狀態的雙鏈 DNA 的比吸光系數為 0.020 ,變性 DNA 和 RNA 的比吸光系數為 0.022 。
通常以 1OD 值相當于 50 μ g / mL 雙螺旋 DNA ,或 40 μ g / mL 單螺旋 DNA (或 RNA ),或 20 μ g / mL 寡核苷酸計算。
這個方法既快速,又相當準確,而且不會浪費樣品。
對于不純的核酸可以用瓊脂糖凝膠電泳分離出區帶后,經啡啶溴紅染色而粗略地估計其含量。
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