氨基酸的紙層析法原理和方法步驟
一、目的
色層分析法已廣泛地用于氨基酸、核酸、激素、維生素、糖類等的分離與分析。其優(yōu)點是：能夠分離與分析在組成、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)上極為相似的物質(zhì)；設(shè)備簡單，操作容易，樣品用量少，結(jié)果也較準(zhǔn)確。
本實驗的目的在于掌握紙層析法的一般原理和操作技術(shù)。
二、原理
紙層析法是以濾紙作為支持物的分配層析法。分配層析法是利用物質(zhì)在兩種不同混合溶劑中的分配系數(shù)不同，而達到分離的目的。通常用@表示分配表示分配系數(shù)。在一定條件下，一種物質(zhì)在某溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)是一個常數(shù)。
α= 溶質(zhì)在靜止相的濃度（Cs ）/ 溶質(zhì)在流動相濃度（CL ）
本實驗層析溶劑是選用有機溶劑和水組成的。由于濾紙纖維與水有較強的親和力（紙上有很多-OH基與水以氫鍵相連），吸附很多水分，一般達濾紙重的22%左右（其中約有6%的水與纖維素結(jié)合成復(fù)合物），因此使這部分水?dāng)U散作用降低形成靜止相。
層析時，將濾紙的親和力很弱，可以在濾紙的毛細(xì)管中自由流動，便形成流動相。層析時，將濾紙一端浸入層析溶液中。有機溶劑連續(xù)不斷地通過點有樣品的原點處，使其中的溶質(zhì)依據(jù)本身的分配系數(shù)在兩相間進行分配。
分配過程：一部分溶質(zhì)隨有機相移動離開原點而進入無溶質(zhì)區(qū)，并重新分配，即一部分溶質(zhì)從有機相又進入水相。
隨著有機相不斷向前移動，溶質(zhì)不斷地在兩相間進行可逆的分配，不斷向前移動。各種物質(zhì)因其分配系數(shù)的不同，在兩相間分配系數(shù)就不同，分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動相中分配的數(shù)量多，移動的速度慢。所以各種溶質(zhì)在層析過程中由于移動的速度不同便可以彼此分開。
移動速度一般用移動速率Rf值表示：
Rf= 原點到層析點中心的距離/ 原點到溶劑前沿的距離
各種化合物在恒定條件下，經(jīng)層析后都有其一定的Rf值，也就是說在層析譜中有一定的位置。借此可以達到定性、分離、鑒別的目的。
Rf值決定于很多因素，其中最主要的是所分離物質(zhì)的分配系數(shù)。物質(zhì)的分配系數(shù)是由以下因素決定的：
（1）物質(zhì)極性的大小。水的極性很強，一般極性強的物質(zhì)就容易進入水相，非極性的物質(zhì)易進入有機溶劑中。例如側(cè)鏈含-OH和-NH2、-COOH較多的氨基酸易分配在水相中，Rf值較小；而含非極性基（如-CH3）較多的物質(zhì)其分子的極性降低，Rf值增大。
（2）濾紙的質(zhì)地以及為水分飽和的程度。濾紙的質(zhì)地必須均一、純凈、厚薄適當(dāng)，具有一定的機械強度，層析前應(yīng)為水和有機溶劑的蒸汽所飽和。
（3）溶劑的純度、PH值和含水量。PH值和含水量改變可使氨基酸和層析溶劑極性改變，Rf值也隨之改變。
（4）層析的溫度和時間。溫度改變使溶劑中有機相含水量改變，Rf值也改變。當(dāng)所有條件相同時，層析時間短，則Rf值小。
因此，在層析過程中，對以上影響Rf值的因素必須嚴(yán)格控制。
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