總維生素C的測定—2，4—二硝基苯肼比色法
一、實驗目的
1.了解天然維生素C 的結構功能以及天然存在形式。
2.掌握測定總維生素C 的原理與方法。
二、實驗原理
總抗壞血酸包括還原型Vc、脫氫型Vc 和二酮古龍糖酸。樣品中還原型抗壞血酸經活性炭氧化為脫氫抗壞血酸，再與2，4 — 二硝基苯肼作用生成紅色脎。脎在硫酸溶液中的含量與總抗壞血酸含量成正比，由此通過比色可對樣品中總壞血酸進行定量。
三、儀器和試劑
儀器
恒溫箱：37±0.5℃、可見—紫外分光光度計 、組織搗碎機。
試劑
本實驗用水均為蒸餾水，試劑純度均為分析純。
1.4.5mol/L 硫酸：小心將250mL 硫酸(比重1.84)加入到700mL 水中，冷卻后用水稀釋至1000mL。
2.85%硫酸：小心將90mL 硫酸(比重1.84)加入到100mL 水中，攪拌均勻。
3.2% 2，4 —二硝基苯肼溶液：溶解2g2，4 — 二硝基苯肼于100mL 4.5mol/L 硫酸內，過濾。不用時存于冰箱內，每次用前必須過濾
4.2%草酸溶液：溶解20g 草酸(H2C2O4)于700mL 水中，再加水稀釋至1000mL。
5.1%草酸溶液：稀釋500mL 2%草酸溶液到1000mL。
6.1%硫脲溶液：溶解5g 硫脲于500mL 1%草酸溶液中。
7.2%硫脲溶液：溶解10g 硫脲于500mL 1%草酸溶液中。
8.1mol/L 鹽酸：取100mL 鹽酸，加入水中，并稀釋至1200mL。
9.抗壞血酸標準溶液(1mg/mL)：溶解100mg 純抗壞血酸于100mL 1%草酸中。
10.活性炭：將100g 活性炭加到750mL1mol/L 鹽酸中，回流1～2h，過濾，用水洗數次，至濾液中無鐵離子(Fe 3+ )為止，然后置于110℃烘箱中烘干。
檢驗鐵離子方法：利用普魯士藍反應。將2%亞鐵氰化鉀與1%鹽酸等量混合，將上述洗出濾液滴入，如有鐵離子則產生藍色沉淀。
四、操作步驟
(一)樣品的制備
全部實驗過程應避光。
1.浸提：
鮮樣的制備：稱100g 鮮樣和100g 2%草酸溶液，倒入搗碎機中打成勻漿，取10～40g 勻漿(含1～2mg 抗壞血酸)倒入100mL 容量瓶中，用1%草酸溶液稀釋至刻度，混勻。
干樣制備：稱1～4g 干樣(含1～2mg 抗壞血酸)放入乳缽內，加入1%草酸溶液磨成勻漿，倒入100mL容量瓶內，用1%草酸溶液稀釋至刻度，混勻。
將浸提液過濾，濾液備用。不易過濾的樣品可用離心機 沉淀后，傾出上清液，過濾，備用。
2.氧化處理：
取25mL 上述濾液，加入2g 活性炭，振搖1min，過濾，棄去最初數毫升濾液。取10mL 此氧化提取液，加入10mL 2%硫脲溶液，混勻。
3.呈色反應
于三個試管中各加入4mL 上述混有硫脲的氧化提取液。一個試管作為空白，在其余試管中加入1.0mL 2% 2，4 — 二硝基苯肼溶液，將所有試管放入37±0.5℃恒溫箱或水浴中，保溫3h。3h 后取出，除空白管外，將所有試管放入冰水中，空白管取出后使其冷到室溫。然后加入1.0mL 2%2，4 — 二硝基苯肼溶液，在室溫中放置10～15min 后放入冰水內。當試管放入冰水后，向每一試管中加入5mL 85%硫酸，滴加時間至少需要1min，需邊加邊搖動試管。硫酸滴加完畢，將試管自冰水中取出，在室溫準確放置30min 顯色。
4.比色
用1cm 比色杯，以空白液調零點，于500nm 波長測吸光值。
(二)標準曲線繪制
加2g 活性炭于50mL 標準溶液中，搖動1 min，過濾。取10mL 濾液放入500mL 容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀釋至刻度，抗壞血酸濃度20μg/mL。
取5，10，20，25，40，50，60稀釋液，分別放入7個100mL 容量瓶中，用1%硫脲溶液稀釋至刻度，使最后稀釋液中抗壞血酸的濃度分別為1，2，4，5，8，10，12μg/mL。按樣品測定步驟形成脎并比色。
以吸光值為縱坐標，以抗壞血酸濃度(μg/mL)為橫坐標繪制標準曲線。
五、計算
式中： X—樣品中總抗壞血酸含量，mg/100g；
c—由標準曲線查得或由回歸方程算得”樣品氧化液”中總抗壞血酸的濃度，μg/mL；
V—試樣用1%草酸溶液定容的體積，mL；
F—樣品氧化處理過程中的稀釋倍數；
m—試樣質量，g。
同一實驗室平行或重復測定，相對偏差絕對值≤10%。
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