酶促反應與時間的關系——初速度時間范圍測定
[原理]
酸性磷酸酯酶（Acid phosphatase E.C.3.1.3.2）廣泛分布于動物和植物中，植物的種子、霉菌、肝臟和人體的前列腺中。它對生物體核苷酸、磷蛋白和磷脂的代謝，骨的生成與磷酸的利用，都起著重要的作用。
酸性磷酸酯酶是酶動力學研究的好材料。它能專一性水解磷酸單酯鍵。本實驗選用綠豆芽作材料，從中提取酸性磷酸酯酶。以人工合成的對-硝基苯磷酸酯(NPP)作底物，水解產生對-硝基酚和磷酸。在堿性溶液中，對-硝基酚鹽離子于405nm處光吸收強烈，而底物沒有這種特性。
利用產物的這種特性，可以定量地測定產物的生成量，從而求得酶的活力單位。即測定單位時間內405nm處光吸收值的變化，來確定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶一個活力單位是指在酶反應的最適條件下，每分鐘生成1μmol產物所需的酶量。
要進行酶活力測定，首先要確定酶反應時間，酶的反應時間應該在初速度時間范圍內選擇。可以通過進程曲線的制作而求出酶的初速度時間范圍。本實驗進程曲線是在酶反應的最適條件下采用每隔一定時間測產物生成量的方法，以酶反應時間為橫坐標，產物生成量為縱坐標繪制而成。
從進程曲線可知，在曲線起始一段時間內為直線，其斜率代表初速度。隨反應時間延長，曲線趨于平坦，斜率變小，反應速度下降。要真實反映出酶活力大小，就應在初速度時間內測定。求出酶反應初速度的時間范圍是酶動力學性質的一系列研究中的組成部分和必要前提。
[ 試劑和器材]
1、 試劑 ：
（1）酸性磷酸酯酶原酶液
取萌發好的綠豆芽，剪去根的頭部，稱取豆芽莖20g，用蒸餾水洗干凈，用研缽研碎，加0.2mol/L乙酸鹽緩沖液4mL，置冰箱6小時以上。
將上述綠豆芽浸液倒入紗布內壓榨，榨出液3 000r/min離心15min，上清液置透析袋對蒸餾水充分透析，間隔換水10次，透析24h以上。將透析后酶液稀釋至最終體積與豆芽莖克數相等，以3 000r/min離心30min，所得的上清液即為原酶液，置冰箱待用。
（2）酸性磷酸酯酶液
取原酶液，用0.05mol/L pH5.0檸檬酸鹽緩沖液稀釋，使進程曲線中第11號管吸光度A405在0.6—0.7之間。
（3）1.2 mmol/L對-硝基苯磷酸酯（NPP）
精確稱取NPP 0.4454g，加緩沖液定容至1000 mL。
（4）0.3 mol/L NaOH。
2、器材：
（1）恒溫水浴槽
（2）可見光分光光度計
（3） 試管 、刻度吸管
[方法和步驟]
取 試管 12支，按下表編號，0號為空白。各管加入1.0mL 1.2 mmol/L NPP；另外2支試管，各加入稀釋好的酶液7 mL，在酶反應前底物與酶都放入35℃恒溫 水浴 槽中預熱2分鐘。然后向1～11號管內各加入1.0 mL 預熱的酶液。立即搖勻并開始計時。
按時間間隔為3、5、7、10、12、15、20、25、30、40、50分鐘進行反應。待反應進行到上述各相應時間時，加入3.0 mL 0.3 mol/L NaOH終止反應。冷卻后以0號管作空白，在 分光光度計 上測定各管A 405 值。
* 0號管加入1.0mL NPP后保溫25分鐘，然后加入3 mL 0.3 mol/L NaOH，再加入1.0 mL酶液。
[數據處理]
以反應時間為橫坐標，A405為縱座標繪制進程曲線，由進程曲線求出酸性磷酸 酯酶 反應初速度的時間范圍。
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