抗壞血酸含量測定（ 2,6 一二氯酚靛酚法）
一、目的
學習維生素 C 的生理功能和性質，掌握用 2 ， 6 一二氯酚靛酚法測定維生素 C 的原理和方法。
二、原理
維生素 C 是一種水溶性維生素，是人類營養中最重要的維生素之一，人體缺乏維生素 C 時會出現壞血病，因此它又被稱為抗壞血酸。此外維生素 C 還具有預防和治療感冒以及抑制致癌物質產生的作用。
維生素 C 的分布很廣，尤其在水果（如彌猴桃、橘子、檸檬、山楂、袖子、草莓等）和蔬菜（莧菜、芹菜、青椒、菠菜、黃瓜、番茄等）中的含量更為豐富。
不同栽培條件、不同成熟度和不同的加工貯藏方法，都可以影響水果、蔬菜的抗壞血酸含量。測定抗壞血酸含量是了解果蔬品質高低及其加工工藝成效的重要指標。
維生素 C 在金屬銅和抗壞血酸氧化酶存在下極易氧化，因此，在用銅制品做食品時，維生素 C 易丟失。此外在堿性溶液中，維生素 C 也易被破壞，而在酸性溶液中比較穩定。利用它具有的還原性質可測定其含量。還原型抗壞血酸能被染料 2 ， 6- 二氯酚靛酚氧化為脫氫型，該染料在堿性溶液中呈藍色，在酸性溶液中呈紅色，被還原后變為無色。因此用 2 ， 6 一二氯酚靛酚滴定含有維生素 C 的酸性溶液時，維生素 C 尚未全部被氧化時，則滴下的染料立即使溶液變成粉紅色，當溶液中的抗壞血酸全部被氧化成脫氫抗壞血酸時，滴入的 2 ， 6 一二氯酚靛酚立即使溶液呈現淡紅色。用這種染料滴定抗壞血酸至溶液呈淡紅色為滴定終點，根據染料消耗量即可計算出樣品中還原型抗壞血酸的含量。
三、儀器、試劑和材料
1 .儀器
（ 1 ）天平
（ 2 ）組織搗碎機
（ 3 ）微量滴定管（ 5ml)
（ 4 ）容量瓶（ 50ml)
（ 5 ）刻度吸管（ 5 ml, 10 ml )
（ 6 ）錐形瓶（ 100ml)
2 .試劑
（ 1 ） 1% 草酸溶液：草酸 1g 溶于 l00ml 蒸餾水中
（ 2 ） 2 ％草酸溶液：草酸 2g 溶于 l00ml 蒸餾水中
（ 3 ）壞血酸標準溶液（ 0. 1 mg/ ml) : 精確稱取 l0mg 純抗壞血酸（應為潔白色，如變為黃色則不能用）用 1 ％草酸溶液溶解并定容至 l00ml 。此溶液應貯存于棕色瓶中，最好臨用前配制。
（ 4 ） 0 . 05 ％ 2,6 一二氯酚靛酚溶液：稱取 500mg 2, 6- 二氯酚靛酚溶于 300ml 含 104 mg 碳酸氫鈉（ A. R ）的熱水中，冷卻后用蒸餾水稀釋至 1000ml ，濾去不溶物，貯存于棕色瓶中， 4''C 冷藏可穩定一周，臨用前以標準抗壞血酸標定。
3 .材料
新鮮水果或蔬菜
四、操作步驟
1 .提取抗壞血酸
取新鮮水果或蔬菜 50g, 加入 50ml2 ％草酸溶液，用組織搗碎機打成勻漿。過濾取得濾液，濾餅可用少量 2 ％的草酸洗幾次，合并濾液，記錄濾液體積。
2 . 2 ， 6 一二氯酚靛酚溶液的標定
準確吸取 4 . Oml 抗壞血酸標準液（含 0 . 4g 抗壞血酸）于 l00ml 錐形瓶中，加 16ml 1 ％草酸溶液，用 2 ， 6 一二氯酚靛酚滴定至淡紅色（ 15 秒內不褪色即為終點）。記錄所用染料溶液的體積，計算出 l ml 染料溶液所能氧化抗壞血酸的量。
3 .樣品滴定
準確吸取樣品提取液兩份，各 20ml ，分別放入兩個 100ml 錐形瓶中，滴定方法同 2 中的操作，另取 20ml 1 ％草酸作空白對照滴定。
五、結果處理
取兩份樣品滴定所耗用染料體積的平均值，代入下式計算 100g 樣品中還原型抗壞血酸的含量：
式中， V 1 為滴定樣品所耗用的染料的平均毫升數；
V 2 為滴定空白對照所耗用的染料的平均毫升數；
V 為樣品提取液的總體積；
V 3 為滴定時所取的樣品提取液的毫升數；
M 為 l ml 染料所能氧化抗壞血酸的量（ mg ）（可由操作 2 計算得到）；
W 為待測樣品的重量（ g ）。
六、注意事項
（ 1 ）用本法測定抗壞血酸含量雖簡便易行，但有下述缺點：第一，本法只能測定還原型抗壞血酸，不能測出具有同樣生理功能的氧化型抗壞血酸和結合型抗壞血酸。第二，樣品中的色素經常干擾對終點的判斷，雖可預先用自陶土脫色，或加入 2-3 ml 二氯乙烷，以二氯乙烷層變紅為終點，但實際上仍難兔產生誤差。
（ 2 ）用 2 ％草酸制備提取液，可有效地抑制抗壞血酸氧化酶，以免抗壞血酸變為氧化型而無法滴定，而 1 ％的草酸無此作用。
（ 3 ）如樣品中有較多亞鐵離子（ Fe 2+ ）時，也可使染料還原而影響測定，這時應改用 8 ％乙酸代替草酸制備樣品提取液，此時 Fe 2 ＋ 不會很快與染料起作用。
（ 4 ）如樣品漿狀物泡沫過多，可加幾滴辛醇或丁醇消泡。
（ 5 ）市售的 2 ， 6 一二氯酚靛酚質量不一，以標定 0.4mg 抗壞血酸消耗 2ml 左右的染料為宜，可根據標定結果調整染料溶液濃度。
（ 6 ）樣品提取制備和滴定過程中，要避免陽光照射和與銅、鐵器具接觸，以免破壞抗壞血酸。
（ 7 ）滴定過程宜迅速，一般不超過 2min ，樣品滴定消耗染料 1 - 4 ml 為宜，如超出此范圍，應增加或減少樣品提取液的用量。
（ 8 ）提取的漿狀物如不易過濾，亦可進行離心收集上清液。
七、思考題
1 .維生素 C 具有什么性質和生理功能？
2. 為了在實驗中得到準確的抗壞血酸含量應注意哪些問題？
參考文獻
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